洋蔥鱗莖顏色遺傳與分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

徐宏志，劉冰江，任秀梅，王勇，吳雄，楊妍妍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.臨沭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 臨沭 276700）

洋蔥（Allium cepa L.）又稱玉蔥、圓蔥等，屬于石蒜科蔥屬蔬菜［1］，以肥大的肉質(zhì)鱗莖為食用器官，富含類黃酮、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)人類心血管疾病、糖尿病和支氣管哮喘有較好的輔助治療作用，對(duì)癌癥、高血壓和高血脂也能起到良好的預(yù)防功效，具有較高的食用和藥用價(jià)值［2］。鱗莖顏色是與洋蔥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品性直接相關(guān)的重要特征之一，也是洋蔥的一個(gè)重要育種性狀，既是為了滿足消費(fèi)者需求，也是因?yàn)橹参锷嘏c人類健康密切相關(guān)［3］。

洋蔥屬于二年生異花授粉植物，育種周期長(zhǎng)，選育符合需求的不同皮色的品種非常困難。本文對(duì)影響洋蔥鱗莖皮色形成的重要代謝物類黃酮的生物合成途徑、調(diào)控鱗莖顏色機(jī)制以及類黃酮代謝途徑中重要結(jié)構(gòu)基因的分子標(biāo)記進(jìn)行了綜述，以期為洋蔥鱗莖皮色改良相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，從而拓寬洋蔥種質(zhì)材料遺傳背景，快速高效選育具有目標(biāo)皮色的洋蔥品種，有效地提高洋蔥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。

1 洋蔥鱗莖不同皮色表型形成原因

鱗莖皮色是洋蔥產(chǎn)品器官最顯著的特征，有白色、黃色、金黃色、淺紅色或紅色，導(dǎo)致洋蔥鱗莖出現(xiàn)不同顏色的自然產(chǎn)物主要為類黃酮化合物。類黃酮化合物的種類和積累水平不同，使得洋蔥鱗莖形成了多種顏色表型［4］。類黃酮代謝涉及多種關(guān)鍵酶包括查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃酮 醇合 成 酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）、二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）等，這些酶相關(guān)基因的突變是造成鱗莖顏色變異的主要原因［5-10］。紅皮洋蔥富含花青素，淡黃皮洋蔥富含黃酮醇，亮黃皮洋蔥富含查爾酮。其中，黃酮醇含量在不同洋蔥品種中變化很大，黃皮品種含量在270～1 187 mg·kg-1FW之間，紅皮品種含量在415～1 917 mg·kg-1FW之間，而白皮品種鱗莖中黃酮醇含量非常少；花青素在紅皮品種中含量較高，大約占總類黃酮含量的10%［11］。

2 環(huán)境因子對(duì)洋蔥鱗莖類黃酮含量與顏色的影響

不同品種、不同發(fā)育階段、不同環(huán)境條件下，洋蔥鱗莖中的類黃酮化合物組成和含量不同。研究表明，環(huán)境因素對(duì)洋蔥中槲皮素含量的影響比土壤類型和生長(zhǎng)時(shí)期更大［12］，在恒溫恒濕冷藏條件下，槲皮素糖苷在整個(gè)儲(chǔ)藏期內(nèi)均保持較高濃度［13］。收獲時(shí)間對(duì)洋蔥類黃酮含量有很大影響，洋蔥生長(zhǎng)期的大部分類黃酮合成發(fā)生在收獲前的最后幾周，收獲后放在大田晾曬10 d左右，可顯著提高洋蔥可食部分的黃酮含量；栽培措施會(huì)影響洋蔥鱗莖顏色和類黃酮含量，但土施氮肥對(duì)洋蔥類黃酮水平的影響很?。?4］?；ㄉ蘸康募竟?jié)變化表明，太陽照射和溫度是影響花色苷積累的重要因素。干燥和炎熱季節(jié)生長(zhǎng)的洋蔥類黃酮含量較高，而在空氣和土壤溫度低、土壤含水量高條件下生長(zhǎng)的洋蔥類黃酮含量較低［15］。貯藏過程中光照處理提高了洋蔥中槲皮素的水平；經(jīng)較低溫度處理的紅洋蔥品種含有更多的花青素，外皮顏色更深，而在常溫貯藏過程中洋蔥花青素含量能降低63%～75%［16-18］。

3 洋蔥鱗莖顏色的遺傳模式

洋蔥鱗莖顏色的遺傳模式比較復(fù)雜，早期研究認(rèn)為洋蔥鱗莖顏色主要由I、C、G、L和R 5個(gè)基因位點(diǎn)控制［19-22］。其中，C為基本色素基因，對(duì)c為完全顯性。當(dāng)C位點(diǎn)是純合隱性（cc）時(shí)，不管其他位點(diǎn)是什么基因型，鱗莖外皮都表現(xiàn)為白色，而至少需要一個(gè)顯性的C等位基因鱗莖才表現(xiàn)為黃色或紅色，這意味著該白色對(duì)黃色或紅色是隱性的，稱為隱性白色。在隱性白鱗莖中沒有檢測(cè)到槲皮素或花青素化合物。

I為顏色抑制基因，如果I位點(diǎn)的基因型是純合顯性的，那么無論其他位點(diǎn)如何，鱗莖的顏色都會(huì)變成白色；但當(dāng)I位點(diǎn)基因型為雜合時(shí)，出現(xiàn)乳白色或淺黃色鱗莖。由于I位點(diǎn)賦予的白色相對(duì)于黃色和紅色是顯性的，這種類型的白色鱗莖顏色被稱為顯性白色。I位點(diǎn)的因果基因仍不清楚，只是被定位到3號(hào)染色體上［23］。

L和R位點(diǎn)與紅色外皮相關(guān)，至少有一個(gè)顯性基因存在時(shí)才會(huì)表現(xiàn)為紅色，L和R位點(diǎn)都是純合顯性時(shí)鱗莖外皮表現(xiàn)為深紅色；如果兩個(gè)位點(diǎn)中的任何一個(gè)是隱性純合，則不會(huì)出現(xiàn)紅色鱗莖。Khar［24］和Duangjit［25］等發(fā)現(xiàn)了與L連鎖的第二個(gè)位點(diǎn)（L2），在該位點(diǎn)上顯性等位基因與R位點(diǎn)相互作用以調(diào)控鱗莖的紅色。

G位點(diǎn)與黃色有關(guān)，iiC-G-的基因型為金黃色，純合隱性基因型（iiC-gg）為黃色［19］。

4 類黃酮代謝關(guān)鍵基因與洋蔥鱗莖顏色形成

4.1 結(jié)構(gòu)基因

4.1.1 DFR和ANS DFR基因在控制花青素和原花色素生物合成途徑中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)DFR基因僅在紅皮洋蔥中表達(dá)，DFR-A基因缺失突變導(dǎo)致不能產(chǎn)生花青素而形成黃色鱗莖［26，27］。兩個(gè)淺紅色洋蔥的DFR基因都是雜合的，表明紅色對(duì)黃色的不完全顯性。

大多數(shù)淺紅色洋蔥具有純合隱性ANS基因，表明淺紅色是由單個(gè)基因控制的隱性性狀，ANS基因在淺紅色色素沉著中起主要作用［28］。遺傳分析表明，在源自黃色和深紅色親本的F3群體中，淺紅色洋蔥的ANS基因表達(dá)降低，且存在8個(gè)SNPs和10 bp的缺失，但進(jìn)一步研究表明這些突變可能不會(huì)導(dǎo)致淺紅色，順式作用元件的突變可能是ANS基因表達(dá)減少的原因［29］。對(duì)來自兩種洋蔥的ANS基因啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序，在淺紅色等位基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了390 bp的插入［27］，在ANS-P等位基因的啟動(dòng)子區(qū)插入了一個(gè)6 258 bp的非自主轉(zhuǎn)座子［30］。

4.1.2 CHS和CHI CHS基因編碼的查爾酮合成酶是類黃酮化合物代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶，CHI基因編碼的查爾酮異構(gòu)酶催化第二步反應(yīng)?；豇P梅等［31］克隆了洋蔥AcChsA基因啟動(dòng)子，通過瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證了具有活性的AcChsA啟動(dòng)子。Kim等（2005）觀察到從分離群體中選擇的白皮洋蔥中兩個(gè)同源CHS基因（CHS-A和CHS-B）的轉(zhuǎn)錄顯著降低，然而，CHS-B基因中的SNP標(biāo)記并不與顏色表型共分離，并且CHS-A基因序列在分離群體中是單態(tài)的，推測(cè)控制CHS基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)調(diào)節(jié)基因可能會(huì)導(dǎo)致洋蔥鱗莖呈現(xiàn)白皮［32］。

Kim等［33］從美國(guó)黃皮洋蔥與巴西黃皮洋蔥雜交的F3群體中發(fā)現(xiàn)了含有少量槲皮素的金黃色洋蔥，對(duì)其CHI基因測(cè)序顯示編碼區(qū)提前出現(xiàn)終止密碼子，造成CHI基因突變失活，而且所有金黃色F2群體中都發(fā)現(xiàn)了純合CHI等位基因的突變，推測(cè)CHI基因突變失活導(dǎo)致了查爾酮衍生物的累積，最終使洋蔥呈金黃色。

4.1.3 其他相關(guān)結(jié)構(gòu)基因 UDP葡萄糖-類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycose flavonoid glycosyltransferase，UFGT）是花色素苷合成的最后一個(gè)酶，它可以將不穩(wěn)定的花色素催化成花色素苷。與黃色鱗莖相比，隱性白洋蔥鱗莖中所有結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平和UFGT的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低［34］。類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）在深紅皮洋蔥的生物合成中起重要作用，F(xiàn)3′5′H/F3′H的比值可能決定洋蔥鱗莖顏色的多樣性［35］。梁毅等［36-38］從洋蔥鱗莖中克隆到花青素合成相關(guān)基因PAL、UFGT，其在紅皮洋蔥膨大初期大量表達(dá)，之后迅速降低至一定程度后趨于相對(duì)平穩(wěn)表達(dá)，與花青素的積累過程相一致；但其在黃皮和白皮洋蔥中表達(dá)量極低。

4.2 調(diào)節(jié)基因

類黃酮生物合成的主要調(diào)控點(diǎn)通常發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，不同的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)蛋白參與了類黃酮生物合成的調(diào)控。

4.2.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子 MYB轉(zhuǎn)錄因子在類黃酮生物合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用，是花青素合成的正調(diào)控因子［39，40］。Schwinn等從洋蔥中分離到與類黃酮途徑不同分支調(diào)控相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，屬于共同激活花青素或黃酮醇合成或抑制苯丙酮/類黃酮合成的亞群；其中，MYB1是花青素生物合成的正調(diào)控因子，瞬時(shí)過表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)花青素產(chǎn)生，而RNAi瞬時(shí)抑制時(shí)則通過減少色素沉著來調(diào)節(jié)花青素合成［41］。

4.2.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子 bHLH編碼基因可調(diào)控植物花青素生物合成途徑。Jo等［42］從洋蔥中發(fā)現(xiàn)了編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的B2基因，在白色個(gè)體和F2、F3群體中轉(zhuǎn)錄水平顯著降低；在該基因啟動(dòng)子區(qū)域的白色等位基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)577 bp的非自主DNA轉(zhuǎn)座子（AcWHITE），但在紅皮和黃皮洋蔥中都沒有AcWHITE插入，推測(cè)B2基因可能是C位點(diǎn)的一個(gè)因果基因，而且認(rèn)為B2基因中這一非自主DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座是導(dǎo)致洋蔥隱性白色鱗莖的原因。

5 顏色相關(guān)基因的定位與分子標(biāo)記

關(guān)于洋蔥重要農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記研究，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核育性分子標(biāo)記方面已經(jīng)有相對(duì)比較成熟的標(biāo)記應(yīng)用于輔助育種工作［43-46］，但針對(duì)洋蔥不同鱗莖顏色的功能標(biāo)記相對(duì)較少。Kim等［7］根據(jù)ANS等位基因的插入突變?cè)O(shè)計(jì)了一種基于PCR的分子標(biāo)記，該標(biāo)記與F2群體的顏色表型完全共分離，可用于輔助選擇ANS的多個(gè)等位基因。Kim等［5］從韓國(guó)和日本的黃皮洋蔥育種材料中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的DFR-A等位基因，利用DFR-APS等位基因啟動(dòng)子區(qū)域20 bp的簡(jiǎn)單重復(fù)序列缺失開發(fā)了一種基于PCR的分子標(biāo)記，用來篩選黃皮洋蔥材料；利用黃色DFR-A等位基因在3′區(qū)域大約800 bp的缺失開發(fā)出一個(gè)基于共顯性PCR的標(biāo)記，該標(biāo)記與F2群體中的顏色表型完全分離。根據(jù)黃皮和紅皮洋蔥DFR基因2%的多態(tài)核苷酸序列設(shè)計(jì)了PCR-RFLP標(biāo)記，在F2群體中與紅色表型共分離［25］。

Baek等［34］報(bào)道的以GST編碼基因?yàn)榛A(chǔ)的GST1標(biāo)記與C位點(diǎn)有較好的連鎖關(guān)系，且因來自候選基因本身，不涉及重組，非?？煽?，有望成為洋蔥育種的有用工具，無需進(jìn)行繁瑣、費(fèi)時(shí)的測(cè)交，就可在短時(shí)間內(nèi)有效區(qū)分黃白色親本雜交產(chǎn)生的純合顯性和雜合性黃色個(gè)體。Havey等［47］在黃褐色與黃皮洋蔥雜交的F2群體中進(jìn)行SNP基因分型，得到與G位點(diǎn)連鎖的共顯性SNP標(biāo)記，這有助于將隱性黃褐色鱗莖顏色基因?qū)肫渌笫[群體中，用于這種獨(dú)特顏色洋蔥的商業(yè)化生產(chǎn)。

6 結(jié)語

影響洋蔥鱗莖皮色變異的遺傳因素非常復(fù)雜，涉及多個(gè)基因及其相互作用。由于基因組龐大（16.3 Gbp）、生育期長(zhǎng)、異花授粉、存在高度自交衰退現(xiàn)象，洋蔥基因組學(xué)和遺傳學(xué)研究非常困難［48，49］，因此關(guān)于洋蔥鱗莖皮色的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展緩慢，幾乎沒有簡(jiǎn)單實(shí)用的可直接應(yīng)用于洋蔥皮色育種工作的分子標(biāo)記。今后可以利用各種組學(xué)技術(shù)研究洋蔥中類黃酮及其生物合成，進(jìn)一步闡明洋蔥鱗莖顏色發(fā)育的機(jī)制，分析不同顏色洋蔥中結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的差異表達(dá)。此外，基因編輯技術(shù)在精確利用洋蔥類黃酮途徑相關(guān)基因來定向改變鱗莖顏色方面也具有巨大的潛力。洋蔥全基因組測(cè)序的初步完成［50］，使分析洋蔥豐富的轉(zhuǎn)錄組成為可能，這將進(jìn)一步推動(dòng)洋蔥鱗莖顏色形成的分子機(jī)制的揭示。