響應(yīng)面優(yōu)化花生蛋白抗菌肽制備工藝

江晨，齊宏濤，于麗娜，彭婭萍，楊偉強(qiáng)，畢潔，王明清，孫杰，，宋昱

（1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071）

花生含有25%～36%的蛋白質(zhì)，而花生粕含有約50%的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)［1］。花生粕經(jīng)不同的提取技術(shù)可以得到花生濃縮蛋白、分離蛋白、磷酸化改性蛋白、限制性酶解蛋白、糖基化改性蛋白、磷酸化改性蛋白膜等多種花生蛋白精深加工產(chǎn)品［2-7］，應(yīng)用在不同的食品領(lǐng)域。此外，花生蛋白還可以進(jìn)一步制備成抗氧化肽、血管緊張素抑制活性肽（ACE抑制肽）、α-葡萄糖苷酶抑制活性肽、醒酒肽、抗菌肽等不同生理功能的花生蛋白肽產(chǎn)品［8-12］，提高花生蛋白的附加值。

抗菌肽分為內(nèi)源和外源抗菌肽兩大類，內(nèi)源抗菌肽由生物體內(nèi)提?。?3］，外源抗菌肽由化學(xué)合成法、基因工程法、微生物發(fā)酵法和酶解法獲得［14-17］。由于酶解法具有反應(yīng)條件溫和、無有機(jī)試劑和有毒化學(xué)品殘留、酶解效率和產(chǎn)物活性高的特點(diǎn)，已成為食品和天然產(chǎn)物領(lǐng)域制備抗菌肽的主要方法。大多數(shù)抗菌肽分子量小于10 kDa，存在于動(dòng)物或植物蛋白序列中，經(jīng)蛋白酶水解后成為有活性的抗菌肽。目前，一些學(xué)者制備了植物源蛋白酶解的抗菌肽如花生蛋白抗菌肽［12］、棉籽蛋白抗菌肽［17］、紫蘇蛋白抗菌肽［18］、苦蕎蛋白抗菌肽［19］等，這些抗菌肽一般具有廣譜抗菌活性。本研究擬采用超聲波輔助Alcalase（堿性蛋白酶）酶解花生蛋白制備花生抗菌肽復(fù)合物，以對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉的抑菌率作為考察指標(biāo)，優(yōu)化花生抗菌肽的制備工藝，旨在為花生抗菌肽的分離、純化和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫冷榨花生蛋白粉，青島長壽食品有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase，2.4 L，標(biāo)稱活力2.4 AU·mL-1），丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司；LB和PDA固體培養(yǎng)基，青島生工生物科技有限公司；大腸桿菌（菌種編號(hào)CICC 10354）、枯草芽孢桿菌（菌種編號(hào)CICC 10732）、米曲霉（菌種編號(hào)CICC 2026），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設(shè)備

FR223CN型電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；L420型低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-300GVDV型臺(tái)式三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（上海右一儀器有限公司）；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；VORTEX-GENIE2T型漩渦混合器（美國Scientific Industies公司）。

1.3 超聲波輔助Alcalase酶解花生蛋白制備花生抗菌肽復(fù)合物工藝

取花生蛋白粉放入50 mL塑料離心管中，加入蒸餾水，漩渦混合器混勻；用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，加入Alcalase酶，再加入蒸餾水到離心管指定刻度，漩渦混合器混勻；調(diào)節(jié)溫度、超聲波頻率、超聲波功率，在超聲波清洗器中超聲輔助酶解一定時(shí)間；酶解結(jié)束后在沸水浴中滅酶5 min，立刻在冷水浴中冷卻；然后以4 000 r/min離心10 min，上清液倒入三角瓶中；再向三角瓶中倒入4倍于上清液體積的無水乙醇，搖動(dòng)三角瓶使上清液與無水乙醇混合均勻，將三角瓶貯存于4℃冰箱中，靜置12 h后，以4 000 r/min離心15 min，上清液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，在50℃、真空條件下蒸發(fā)除掉乙醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)液體定容至50 mL，待用。

1.4 超聲波輔助Alcalase酶解花生蛋白制備花生抗菌肽復(fù)合物優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn) 以底物濃度、初始pH值、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、超聲波頻率、超聲波功率作為試驗(yàn)因素，以對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉的抑制率作為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組試驗(yàn)做3個(gè)平板平行試驗(yàn)，取抑制率平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)因素的水平見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平

1.4.2 響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定反應(yīng)時(shí)間40 min、超聲波功率210 W、超聲波頻率28kHz，以底物濃度（X1）、pH值（X2）、加酶量（X3）和溫度（X4）4個(gè)因素為自變量，運(yùn)用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉的抑菌率作為響應(yīng)變量（Y1、Y2和Y3）。各因素的編碼和水平見表2。

表2 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)因素水平

1.5 抑菌率的測(cè)定

將滅菌的LB和PDA固體培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，待其凝固。用接種環(huán)分別挑取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉的斜面菌種各1環(huán)，分別放入滅菌的生理鹽水中，混合均勻，得到3種菌的菌懸液。用滅菌槍頭分別吸取大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌懸液各1 mL到LB平板表面，再取米曲霉菌懸液1 mL到PDA平板表面，用涂布棒將菌懸液涂布均勻。待菌懸液干燥后，以“十”字方式在平板中央和外周擺5個(gè)牛津杯。中央的牛津杯內(nèi)加入滅菌的生理鹽水，四周的牛津杯內(nèi)加入相應(yīng)的花生抗菌肽復(fù)合物。培養(yǎng)皿封口，放到培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37℃培養(yǎng)24 h，米曲霉28℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)量抑菌圈的直徑，抑菌率（%）=抗菌肽抑菌圈直徑（mm）/生理鹽水對(duì)照組細(xì)菌圈直徑（mm）×100。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-Expert（8.0）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 底物濃度對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 圖1A所示，花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌率高于米曲霉。隨著底物濃度增大，花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌率逐漸增大，最大值出現(xiàn)在底物濃度12%；而對(duì)大腸桿菌和米曲霉的抑菌率先增大后減小，最大值都出現(xiàn)在底物濃度8%時(shí)。因此，選擇底物濃度8%～12%作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

2.1.2 pH值對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 蛋白酶水解活性受到反應(yīng)體系pH值的影響。隨著pH值的增大，花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)3種菌的抑菌率都呈增大趨勢(shì)（圖1B），且在pH值8.0～9.0范圍內(nèi)，抑菌率較大，具有較好的活性。因此，選擇pH值8.0～9.0作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

圖1 底物濃度（A）和pH值（B）對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響

2.1.3 加酶量對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)3種菌的抑菌率均呈先減小后增大趨勢(shì)（圖2A）。當(dāng)加酶量為19.2AU·L-1時(shí)，對(duì)3種菌的抑菌率均最小，然后逐漸增大到最大值。加酶量23.0～30.6 AU·L-1的抑菌率總體較高，因此選作響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

圖2 加酶量（A）和溫度（B）對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響

2.1.4 溫度對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 在40～65℃范圍內(nèi)，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌率，變化幅度較平緩，對(duì)大腸桿菌的抑菌率呈波動(dòng)變化，對(duì)米曲霉的抑菌率總體呈現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì)；對(duì)3種菌的抑菌率都在55℃時(shí)最?。▓D2B）。鑒于大腸桿菌和米曲霉的抑菌率在40、50、60℃時(shí)較好，而枯草芽孢桿菌的抑菌率變化較小，將40～60℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

2.1.5 時(shí)間對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 在10～60 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌率先減小后增大，40 min后趨于平穩(wěn)，對(duì)大腸桿菌和米曲霉的抑菌率都是先增大后減?。粚?duì)3種菌的抑菌率都在反應(yīng)40 min時(shí)最大（圖3A）。因此，將40 min作為響應(yīng)面試驗(yàn)固定因素水平。

圖3 反應(yīng)時(shí)間（A）和超聲波頻率（B）對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響

2.1.6 超聲波頻率對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)3種菌的抑菌率都呈先減小后增大的趨勢(shì)，最大值都出現(xiàn)在超聲波頻率為28 kHz時(shí)（圖3B）。因此，將超聲波頻率28 kHz作為響應(yīng)面試驗(yàn)固定因素水平。

2.1.7 超聲波功率對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響 超聲波功率在150～300 W范圍內(nèi)，花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)枯草芽孢桿菌和米曲霉的抑菌率都呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢(shì)，對(duì)大腸桿菌的抑菌率為先增大后減小的趨勢(shì)；對(duì)3種菌的抑菌率都在210 W取得最大值（圖4）。因此，將超聲波功率210 W作為響應(yīng)面試驗(yàn)固定因素水平。

圖4 超聲波功率對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌活性的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立與方差分析 根據(jù)RSM設(shè)計(jì)29組試驗(yàn)（表3），經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合，獲得了相應(yīng)預(yù)測(cè)值與底物濃度（X1）、pH值（X2）、加酶量（X3）和溫度（X4）的二次回歸方程，如下：

表3 RSM設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析結(jié)果（表4）表明，3個(gè)模型的P值均小于0.001，失擬項(xiàng)的P值均大于0.05，信噪比（Adeq Precision）均大于4，模型均具有統(tǒng)計(jì)意義，分辨力較高，可用于對(duì)不同制備條件下的抑菌率進(jìn)行預(yù)測(cè)。3個(gè)模型的相關(guān)系數(shù)（R）分別為0.9916、0.9891、0.9896，矯正決定系數(shù)（）分別為0.9664、0.9568、0.9587，預(yù)測(cè)離差平方和分別為0.9574、0.9429、0.9093，，且變異系數(shù)（CV）分別為2.18%、1.75%、2.73%，均小于10%，說明模型變異小，擬合優(yōu)度好，可用于對(duì)花生蛋白抗菌肽制備工藝的初步分析和預(yù)測(cè)。

表4 回歸模型方差分析

2.2.2 模型回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)與各因素間交互作用 由表5可見，枯草芽孢桿菌模型中，X3對(duì)抑菌率的線性效應(yīng)極顯著和對(duì)抑菌率的曲面效應(yīng)極顯著；X1X2、X1X3、X2X3和X2X4對(duì)抑菌率的交互影響極顯著，X3X4對(duì)抑菌率的交互影響顯著。大腸桿菌模型中，因素X1和X2對(duì)抑菌率的線性效應(yīng)極顯著，X3對(duì)抑菌率的線性效應(yīng)高度顯著和對(duì)抑菌率的曲面效應(yīng)極顯著，對(duì)抑菌率的曲面效應(yīng)顯著；X1X3、X2X3和X3X4對(duì)抑菌率的交互影響極顯著，X1X2對(duì)抑菌率的交互影響顯著。米曲霉模型中，因素X1、X2和X4對(duì)抑菌率的線性效應(yīng)極顯著，X3對(duì)抑菌率的線性效應(yīng)高度顯著和對(duì)抑菌率的曲面效應(yīng)極顯著，對(duì)抑菌率的曲面效應(yīng)高度顯著；X1X2、X1X3、X2X3和X3X4對(duì)抑菌率的交互影響極顯著，X2X4對(duì)抑菌率的交互影響高度顯著。由3個(gè)響應(yīng)面模型回歸方程可以看出，在影響抑菌率的因素中，底物濃度和加酶量與抑菌率呈正相關(guān)，pH值和溫度與抑菌率呈負(fù)相關(guān)。通過比較一次項(xiàng)的方差大小，可以判斷出：枯草芽孢桿菌模型中，各因素對(duì)抑菌率影響程度為X3＞X4＞X1＞X2；大腸桿菌模型中，各因素對(duì)抑菌率影響程度為X1＞X2＞X3＞X4；米曲霉模型中，各因素對(duì)抑菌率影響程度為X1＞X2＞X4＞X3。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

兩兩因素對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌率的響應(yīng)曲面圖見圖5、圖6、圖7。曲面彎曲程度越大，曲線越陡，影響越顯著。

圖5 因素間交互作用對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌率的響應(yīng)曲面圖（枯草芽孢桿菌）

圖6 因素間交互作用對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌率的響應(yīng)曲面圖（大腸桿菌）

圖7 因素間交互作用對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物抑菌率的響應(yīng)曲面圖（米曲霉）

2.2.3 最佳酶解參數(shù)的確定和驗(yàn)證 對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，獲得超聲波輔助Alcalase酶解制備花生蛋白抗菌肽的最優(yōu)條件為底物濃度10.9%、pH值8.26、加酶量26.6 AU·L-1、溫度48.3℃，花生蛋白抗菌肽對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和米曲霉抑菌率理論值分別為130.7%、130.4%和85.4%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法的可行性，并綜合考慮實(shí)際操作的便利性，將工藝參數(shù)修正為底物濃度10.9%、pH值8.3、加酶量26.6AU·L-1、溫度48℃，3次平行試驗(yàn)得到的花生蛋白抗菌肽對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和米曲霉抑菌率分別為132.9%±0.4%、128.6%±0.6%和84.1%±0.8%，與理論值的差異幅度分別為1.68%、1.38%和1.52%，都在2%以內(nèi)，說明模型擬合效果較好，精確度較高。因此，響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助酶解制備花生蛋白抗菌肽工藝條件的參數(shù)優(yōu)化是可行的，得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 討論與結(jié)論

目前，采用蛋白酶水解方法制備抗菌肽的植物蛋白來源主要有條斑紫菜［20］、螺旋藻［21］、壇紫菜［22］、海帶［23］等海藻類蛋白，以及花生［12］、棉籽［17］、紫蘇［18］、核桃［24］等脫脂餅粕類蛋白。其中，螺旋藻、海帶、花生、棉籽和紫蘇蛋白的水解采用堿性蛋白酶，壇紫菜和核桃蛋白的水解用胃蛋白酶，條斑紫菜蛋白水解用木瓜蛋白酶。這些蛋白水解后得到的抗菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌等G-以及金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和鏈球菌等G+具有抑菌活性。大多數(shù)抗菌肽中有一定的疏水性氨基酸殘基，而堿性蛋白酶能高效地水解蛋白肽鏈中羧端疏水性氨基酸，從而得到具有疏水性氨基酸的短肽［25］。在抗菌肽抑菌過程中，這些疏水基團(tuán)易與菌體脂質(zhì)結(jié)合，親水基團(tuán)易與水結(jié)合，通過疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)的相互協(xié)作實(shí)現(xiàn)抑菌活性［26］?；诖?，本研究采用超聲波輔助堿性蛋白酶水解花生蛋白，得到了對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉都有抑菌活性的抗菌肽。

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助堿性蛋白酶酶解制備花生抗菌肽復(fù)合物的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為底物濃度10.9%、初始pH值8.3、加酶量26.6 AU·L-1、超聲波功率210 W、超聲波頻率28 kHz、反應(yīng)體系溫度48℃、反應(yīng)時(shí)間40 min，此條件下制備的花生抗菌肽復(fù)合物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和米曲霉抑菌率分別為132.9%±0.4%、128.6%±0.6%和84.1%±0.8%。本研究為今后花生抗菌肽的分離純化、生物活性、構(gòu)效關(guān)系以及分子改造等研究提供了理論依據(jù)。