雙氫青蒿素抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展*

唐恬，曹祺，夏慶杰

610041 成都，.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)科(唐恬、曹祺);出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川大學(xué)) (唐恬、曹祺)； 610041 成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)中心 神經(jīng)疾病研究室(夏慶杰)

雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是中藥青蒿素的一個(gè)重要半合成衍生物，能作用于紅細(xì)胞內(nèi)期的瘧原蟲超微結(jié)構(gòu)，達(dá)到抗瘧疾的效用。研究表明，DHA除了具有抗瘧作用外，還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有殺傷作用，包括腺癌(乳腺癌，結(jié)腸癌等)，上皮源性腫瘤(卵巢癌及前列腺癌等)，并且它以劑量和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)氧自由基損傷、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)低腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移侵襲等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。研究顯示DHA對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的機(jī)制包括增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響DNA損傷和修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡、自噬、壞死、凋亡)，抑制血管生成及調(diào)控腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2]。惡性腫瘤耐藥與復(fù)發(fā)嚴(yán)重威脅人類生命健康。盡管目前惡性腫瘤的診斷和治療取得了重要進(jìn)步，但化療耐藥的現(xiàn)象已成為治療失敗和復(fù)發(fā)的重要因素，如何有效突破耐藥瓶頸是目前提高腫瘤治療有效率及改善患者預(yù)后的當(dāng)務(wù)之急。于是，尋求高效低毒的抗腫瘤藥物已成為腫瘤研究亟需解決的難題。本文將對(duì)DHA在抗腫瘤中的重要作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 DHA影響鐵代謝和產(chǎn)生氧自由基殺傷腫瘤細(xì)胞

DHA可以通過(guò)影響鐵代謝和活性氧簇實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效用[3]。細(xì)胞增殖需要鐵離子，腫瘤細(xì)胞需要大量亞鐵離子用于DNA合成從而滿足腫瘤細(xì)胞的高速生長(zhǎng)。因此，腫瘤細(xì)胞內(nèi)Fe2+的含量也比正常細(xì)胞明顯更高。DHA的過(guò)氧化橋結(jié)構(gòu)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子反應(yīng)后斷裂，可產(chǎn)生以碳為核心的自由基或ROS[4]。這些氧自由基將氧化修飾腫瘤細(xì)胞生存、增殖所必需的蛋白質(zhì)、脂類等大分子物質(zhì)、干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低腫瘤細(xì)胞增殖率、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、程序性壞死，最終達(dá)到抗腫瘤效用[5]。

多項(xiàng)研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (transferrin receptor，TfR) 在腫瘤細(xì)胞(肺癌、胰腺癌、直腸癌、膀胱癌等)內(nèi)高表達(dá)[6]。正常組織及細(xì)胞內(nèi)的的TfR表達(dá)非常低，僅有肝細(xì)胞、表皮細(xì)胞等少量表達(dá)[6]。借由與TfR形成共價(jià)復(fù)合物，依賴鐵離子的DHA能對(duì)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向性殺傷[7]。正常細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)較少，即使有鐵離子存在也并非具有催化活性的亞鐵離子，不能與DHA的過(guò)氧化橋結(jié)構(gòu)反應(yīng)[7]。因此，DHA的細(xì)胞毒性主要靶向殺傷腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞。 由此，DHA能夠較為特異地殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞組織的毒副作用較小。

目前基于DHA通過(guò)Fe2+離子反應(yīng)產(chǎn)生活性氧抗腫瘤的機(jī)制，人們進(jìn)一步提出了“鐵死亡”概念[8]?！拌F死亡”是由鐵依賴性脂質(zhì)活性氧積累和質(zhì)膜多不飽和脂肪酸消耗引起的程序性細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，DHA處理頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (head neck squamous cell carcinoma,HNSCC) 時(shí)，觀察到典型的“鐵死亡”線粒體形態(tài)改變，同時(shí)活性氧水平升高，但這種升高能被鐵螯合劑抑制，且在DHA處理的HNSCC細(xì)胞中觀察到“鐵死亡”重要調(diào)節(jié)因子GPx4和Ras的水平下降[8]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型口服低劑量的Fe2+溶液顯著增強(qiáng)DHA抗腫瘤作用，即在DHA治療前，預(yù)加入鐵劑或過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白，增加癌細(xì)胞內(nèi)的亞鐵含量，將起到強(qiáng)化DHA殺傷腫瘤細(xì)胞的效用[2,8]。

2 DHA抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

2.1 DHA阻滯細(xì)胞周期

DHA能通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞周期起到抗腫瘤效果。研究顯示，DHA作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，經(jīng)細(xì)胞周期分析顯示，MCF-7細(xì)胞不能順利從G0和G1期進(jìn)入S期[9]。在一項(xiàng)胰腺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，DHA治療影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)酶的表達(dá)(如cyclin E、CDK2、CDK4和p27)，DHA下調(diào)cyclin E蛋白水平，同時(shí)調(diào)低cdk2的表達(dá)，繼而減少cyclin E1蛋白與cdk2的結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞的G1/S轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致劑量依賴性G0/G1細(xì)胞周期阻滯[9-10]。最近的一項(xiàng)研究表明，DHA同樣可以導(dǎo)致人胃癌細(xì)胞系 (SGC-7901, MGC-803) G0/G1細(xì)胞周期阻滯, 并可能通過(guò)cyclin D1-CDK4-Rb信號(hào)通路發(fā)揮上述作用[11]。更多類似研究表明，NCI-H1975細(xì)胞系(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系)細(xì)胞增殖被DHA顯著抑制，腫瘤細(xì)胞被阻滯于G2期[12]。DHA能降低cyclin B1的表達(dá)，使得G2/M期cyclin B1蛋白的合成較少，不足以與Cdc2結(jié)合產(chǎn)生成熟促進(jìn)因子 (maturation-promoting factor, MPF)，而MPF是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從G2期到M期的一個(gè)重要因素[13]。以上研究均表明DHA可能影響腫瘤細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，不能有效進(jìn)行有絲分裂，從而起到抗腫瘤效果。

2.2 DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡能力的減弱甚至喪失是癌癥產(chǎn)生的重要原因，細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控紊亂是腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)與擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。在腫瘤治療研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活線粒體依賴途徑或誘導(dǎo)死亡配體與受體結(jié)合等，可以達(dá)到治療腫瘤的目的[14]。由此可見(jiàn)，關(guān)注腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路在耐藥腫瘤治療中尤為重要。

2.2.1 DHA激活線粒體依賴性細(xì)胞凋亡通路 當(dāng)受到化療藥物等凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體膜通透性就會(huì)發(fā)生改變，線粒體膜電位變化導(dǎo)致細(xì)胞色素C外漏，細(xì)胞質(zhì)同時(shí)釋放多種凋亡相關(guān)因子，從而觸發(fā)caspase和其他的細(xì)胞死亡受體[15]。DHA能使線粒體跨膜電位(ΔΨm)喪失，下調(diào)Bcl-2同時(shí)上調(diào)Bax，加速線粒體膜去極化，改變線粒體通透性，加強(qiáng)Cyt C釋放、Caspase-3、Caspase-9活化誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，而Bcl-2轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞對(duì)DHA具有更強(qiáng)的耐藥性[16-17]。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)DHA能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑關(guān)鍵蛋白GRP78、CHOP和eIF2α的表達(dá)升高，誘導(dǎo)Caspase-12的活化[18-19]。

2.2.2 DHA激活外源性凋亡通路 外源性凋亡通路起始于死亡受體，死亡受體受到刺激繼而引起Caspase鏈級(jí)激活。死亡受體主要包括Fas、TNF、DR3、DR4、DR5等受體，它們能夠被腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體結(jié)合激活，從而激活啟動(dòng)型Caspase引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然后通過(guò)活化的執(zhí)行型Caspase裂解特異性底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。根據(jù)細(xì)胞模型顯示，DHA可上調(diào)Fas/CD95表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位分解、Cyt C釋放、最終激活caspase3/9，起到驅(qū)動(dòng)外源性Fas受體相關(guān)凋亡途徑的作用[21]。

值得關(guān)注的是，當(dāng)前在臨床實(shí)踐中腫瘤細(xì)胞對(duì)多種凋亡誘導(dǎo)藥物可能產(chǎn)生耐藥性，是治療腫瘤失敗的一大主要原因，而體外研究發(fā)現(xiàn)DHA與包括順鉑、達(dá)沙替尼以及長(zhǎng)春新堿在內(nèi)的多種抗腫瘤藥物具有良好的協(xié)同增效作用，而更為重要的是DHA還能誘導(dǎo)上述藥物耐藥細(xì)胞的凋亡，從而起到逆轉(zhuǎn)耐藥的效果[22]。

以上研究均表明，DHA能通過(guò)內(nèi)源及外源機(jī)制共同作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡——凋亡。

2.3 DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬機(jī)制在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及清除癌變細(xì)胞兩方面擔(dān)當(dāng)了“雙刃劍”角色：一方面，自噬能在遭遇不利環(huán)境時(shí)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的耐受能力，維持其生存；另一方面，自噬又能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段抑制其進(jìn)展，以致誘導(dǎo)某些化療耐藥的凋亡缺陷腫瘤細(xì)胞死亡[21-22]。研究提示，DHA主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路，阻滯p65的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而上調(diào)ROS水平，引起線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致載鐵腫瘤細(xì)胞系自噬[23-25]。另有研究提示，DHA新型衍生物DHA-37在人肺癌A549細(xì)胞系中通過(guò)上調(diào)高遷移率族蛋白1，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡[26]。以上研究均提示DHA通過(guò)誘導(dǎo)自噬殺傷凋亡缺陷腫瘤細(xì)胞。

3 DHA抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移

腫瘤細(xì)胞向局部侵犯是侵襲的一種形式。而腫瘤細(xì)胞侵入血管或淋巴管或體腔，進(jìn)而被帶到另一部位或器官，在遠(yuǎn)處發(fā)生發(fā)展，形成與原病灶同源的腫物，是腫瘤侵襲的另一種表現(xiàn)形式[27]。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移將嚴(yán)重影響患者預(yù)后[27-28]。癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移主要與癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)因子、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)分解酶、血管形成因子、細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等因素有著密切聯(lián)系[5,27]。

3.1 DHA抑制腫瘤血管生成

DHA抗腫瘤作用特點(diǎn)是其對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用遠(yuǎn)大于對(duì)正常細(xì)胞組織的毒性作用；DHA對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的作用強(qiáng)弱亦不同，即具有選擇性細(xì)胞毒作用[27-28]。腫瘤血管是腫瘤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的基本條件。癌細(xì)胞能分泌血管生長(zhǎng)因子，譬如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等特異蛋白[29]。血管生長(zhǎng)因子不斷刺激產(chǎn)生腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VEC)，這些因子能促進(jìn)腫瘤微環(huán)境內(nèi)血管生成，為癌細(xì)胞生長(zhǎng)提供養(yǎng)料，同時(shí)為腫瘤轉(zhuǎn)移提供條件[28]。DHA通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)，阻斷VEGF與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)作用，干擾VEC形成，最終抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[27]。由此可見(jiàn)，DHA抑制VEC生成是DHA制約腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵限速步驟[27]。足量DHA可明顯抑制肝腫瘤模型鼠瘤體組織及血清中的VEGF及VEGFR-2的表達(dá)，縮瘤效果明顯，并使模型鼠的生存時(shí)間獲益明顯，由此可見(jiàn)，DHA能通過(guò)有效抑制肝腫瘤血管生成，延緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[30]。類似研究指出，DHA通過(guò)抑制NF-κB/HIF-1α活性，激活I(lǐng)κB，調(diào)低VEGF/VEGFR-2的表達(dá)，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管化生，從而抑制VEC增殖、誘導(dǎo)其走向凋亡，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)腫瘤新生血管功能[31]。DHA抑制食管癌細(xì)胞Eca109內(nèi)NF-κB/VEGF通路后，腫瘤化療敏感性相應(yīng)增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞受到抑制，裸鼠成瘤模型內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)緩慢[32]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是跨膜酪氨酸激酶受體家族的成員，在人類癌癥中廣泛表達(dá)[32]。EGFR在與相應(yīng)的配體結(jié)合后自磷酸化，并激活對(duì)細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤干細(xì)胞富集等諸多過(guò)程至關(guān)重要的下游信號(hào)通路[33-34]。然而其在宮頸癌耐藥及DHA增敏作用中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制尚不明確[35]。本團(tuán)隊(duì)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DHA能夠影響CSCs富集及EGFR的表達(dá)，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未得到充分證實(shí)，這點(diǎn)將受到本課題組的持續(xù)關(guān)注。

3.2 DHA抑制癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移

DHA能調(diào)控腫瘤侵襲相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如MAPKs途徑，EMT途徑)[35]。研究表明，腫瘤溶解外基質(zhì)向外侵襲和轉(zhuǎn)移,在此過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix matalloproteinases,MMPs)是重要調(diào)控分子，MMPs能降解基底膜和基質(zhì)、促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移[34-35]。DHA能抑制MMPs表達(dá)從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[36]。MAPKs調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[37]。DHA一方面抑制PKCα/MAPKs通路，另一方面降調(diào)AP-1蛋白，最終共同降低MMP-9的蛋白水平，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[38]。在人纖維肉瘤細(xì)胞中，DHA可通過(guò)抑制MAPKs家族所含的Jun/Fos等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[38-39]。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(epithelial to mesenchymal transition,EMT)的能力是評(píng)估上皮源性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)[38-39]。EMT發(fā)生時(shí)，上皮腫瘤細(xì)胞極性喪失，間質(zhì)細(xì)胞特性被剝奪，隨之而來(lái)的是腫瘤細(xì)胞遷徙運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，易于穿過(guò)細(xì)胞基底膜[39]。DHA治療上皮源性卵巢癌及前列腺癌細(xì)胞后，上皮組織標(biāo)志鈣粘附蛋白E表達(dá)增多，間質(zhì)組織標(biāo)志(波形蛋白等)表達(dá)減少，卵巢癌及前列腺癌細(xì)胞EMT被顯著抑制，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低[40]。

4 DHA逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥

在當(dāng)前的腫瘤治療中，腫瘤的耐藥與復(fù)發(fā)問(wèn)題尤為棘手。盡管目前診斷和治療方面取得了重要進(jìn)步，但化療耐藥的現(xiàn)象已成為腫瘤治療失敗和復(fù)發(fā)的重要因素。腫瘤的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，主要涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族對(duì)抗腫瘤藥物由內(nèi)到外的轉(zhuǎn)運(yùn)、體內(nèi)酶系統(tǒng)的異常、腫瘤干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞凋亡及自噬異常等[41-42]。針對(duì)腫瘤耐藥的復(fù)雜機(jī)制，DHA可以通過(guò)多種方式發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。DHA可以通過(guò)下調(diào)ATP結(jié)合盒亞族G成員2(ATP binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)的轉(zhuǎn)錄翻譯，并與P-糖蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，減少抗腫瘤藥物的外排[43-44]。此外，如前所述，DHA還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬，并由此在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[22-25]。筆者課題組前期實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)證明DHA能夠有效抑制紫杉醇耐藥的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞增殖并增加其凋亡水平[29,31]。

5 展 望

化療耐藥是影響腫瘤治療有效率和反應(yīng)率以及總體生存率的主要原因，目前已經(jīng)成為困擾惡性腫瘤治療的一大難題[45]?；熌退幙赡苌婕暗郊?xì)胞凋亡等多種途徑的失調(diào)。敏感腫瘤細(xì)胞和耐藥腫瘤細(xì)胞之間的比較表明，化療耐藥可能是多種相關(guān)機(jī)制相互作用的結(jié)果[46]。從天然產(chǎn)物中尋找可用的高效低毒的抗腫瘤活性成分及相應(yīng)分子靶點(diǎn)是當(dāng)前抗腫瘤藥物研究的重要發(fā)展戰(zhàn)略之一[47]。研究者對(duì)DHA這一天然產(chǎn)物衍生物進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的研究，積累了大量的數(shù)據(jù)。筆者長(zhǎng)期致力于DHA抗腫瘤機(jī)制的研究，筆者認(rèn)為：1)DHA通過(guò)凋亡、自噬共同作用，殺傷腫瘤細(xì)胞。然而這種殺傷作用在筆者的前期工作中被證實(shí)可以被si-TfR逆轉(zhuǎn)。這提示我們DHA腫瘤殺傷作用有較大的鐵依賴性；2)筆者在前期工作中發(fā)現(xiàn)DHA通過(guò)上調(diào)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II/I(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II/I,LC3-II/I)，下調(diào)選擇性自噬蛋白P62，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑類藥物的耐藥性，增加鉑類藥物的抗腫瘤能力；3)筆者前期工作中還發(fā)現(xiàn)DHA能顯著下調(diào)MAPKs家族的關(guān)鍵基因Jun/Fos，抑制耐藥癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)耐藥癌細(xì)胞外泌體LncRNA HEIH的表達(dá)也顯著下調(diào)；而在內(nèi)膜癌細(xì)胞中，敲低LncRNA HEIH能明顯下調(diào)MAPKs，并改善腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。這提示我們DHA可能通過(guò)LncRNAHEIH調(diào)控MAPKs，來(lái)改善腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

DHA的抗腫瘤機(jī)制仍不完全清晰，通過(guò)進(jìn)一步探究DHA抗腫瘤機(jī)制，將使其具有更廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)研究DHA新適應(yīng)癥并應(yīng)用于臨床實(shí)踐也將是今后的發(fā)展方向。

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