全寄生植物分枝列當(dāng)愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系建立

董雪，姚兆群，曹小蕾，田芳，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

分枝列當(dāng)(PhelipancheaegyptiacaPers) 屬列當(dāng)科的全寄生性雜草，可寄生葫蘆科、茄科、豆科、菊科、傘形科、土字花科等多種植物，可對甜瓜、籽瓜、番茄、馬鈴薯、煙草、扁豆和胡蘿卜等重要經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。分枝列當(dāng)缺少葉綠素只能通過吸器與寄主維管束連接獲得營養(yǎng)，使得難以篩選出有效殺滅分枝列當(dāng)而對寄主安全的除草劑，同時分枝列當(dāng)寄生過程主要發(fā)生在寄主根部，待其從地下長出后再進(jìn)行化學(xué)防治或者人工拔除，已對寄主造成嚴(yán)重?fù)p失。分枝列當(dāng)?shù)倪@些生物學(xué)特性使其防治極其困難，導(dǎo)致發(fā)生嚴(yán)重地區(qū)的農(nóng)民不得不改種經(jīng)濟(jì)效益低的作物，甚至棄耕土地[4-6]。了解分枝列當(dāng)?shù)募纳^程對制定合理的防控策略具有重要意義，已有轉(zhuǎn)錄組、基因組數(shù)據(jù)分析揭示了一些基因與分枝列當(dāng)種子萌發(fā)、吸器形成及與寄主建立寄生關(guān)系相關(guān)[7-9]，但由于分枝列當(dāng)是全寄生性雜草，缺乏成熟的轉(zhuǎn)化與再生體系，導(dǎo)致相關(guān)基因的功能驗(yàn)證存在困難[10]。

對全寄生種子植物的組織培養(yǎng)研究主要集中于列當(dāng)科的肉蓯蓉上，已從荒漠肉蓯蓉的莖、幼芽、鱗片、花瓣、子房、雄蕊和種子等多種組織和器官中誘導(dǎo)得到了愈傷組織，但沒有培養(yǎng)出組培苗[11-13]。目前已有采用B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)出Phelipancheramosa和用MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)出分枝列當(dāng)愈傷組織的報道，但缺乏進(jìn)一步的研究[14-15]。本研究的目的是優(yōu)化一種能夠產(chǎn)生大量高效再生的分枝列當(dāng)愈傷組織的方法，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和不同激素的組合去誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，并進(jìn)一步通過激素調(diào)節(jié)誘導(dǎo)愈傷組織使其分化，最終為采用遺傳轉(zhuǎn)化研究分枝列當(dāng)侵入寄主以及寄主植物抗性之間的相互作用機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年7月從新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州軍戶農(nóng)場加工番茄上采集成熟的分枝列當(dāng)植株和種子，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定將其鑒定為分枝列當(dāng)，去除雜質(zhì)并在常溫黑暗條件下保存于實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 種子消毒

稱取分枝列當(dāng)種子0.4 g于10 mL離心管中，并在超凈工作臺上用75%的酒精消毒處理5 min，然后再用含有0.02%(V/V)Tween-20的2%(V/V)次氯酸鈉溶液中處理20 min，最后用滅菌的去離子水沖洗5至8次直至上清液變?yōu)榍宄簾o色，對種子進(jìn)行消毒殺菌。

1.3 種子預(yù)培養(yǎng)

將1 mL吸頭剪去0.5 cm，用洗頭吸取消毒處理后的分枝列當(dāng)種子，均勻點(diǎn)放在鋪有2層玻璃纖維濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，并加入2 mL無菌水潤濕。所使用的玻璃纖維濾紙、培養(yǎng)皿及吸頭均需提前在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，并用錫箔紙包裹培養(yǎng)皿保持黑暗條件。

再將處理好的種子置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)4 d后，加入10-7mol/L GR24(人工合成的獨(dú)腳金內(nèi)酯類似物)溶液以刺激分枝列當(dāng)種子萌發(fā)，其中所使用的GR24需過濾除菌(在沒有種子萌發(fā)刺激物的作用下，列當(dāng)種子不萌發(fā))。

1.4 誘導(dǎo)愈傷組織外植體的篩選

分枝列當(dāng)種子在預(yù)培養(yǎng)4天后，分別選擇用GR24處理1、2、3、4、5、6、7 d的種子轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中，每個處理設(shè)3個重復(fù)，4周后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.5 愈傷組織誘導(dǎo)

以MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+600 mg/L水解酪蛋白和B5+3%蔗糖+0.7%瓊脂+600 mg/mL水解酪蛋白(pH5.8)為基本培養(yǎng)基，分別添加1 mg/L 2，4-D、1 mg/L IAA、8 mg/L GA3三種激素的相互組合作為愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所用的激素和培養(yǎng)基見表1。

將萌發(fā)的分枝列當(dāng)種子接種于上述培養(yǎng)基上進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿放入約0.03 g分枝列當(dāng)萌發(fā)的種子，每個處理設(shè)10個重復(fù)，24 ℃暗培養(yǎng)4周后觀察并統(tǒng)計所形成愈傷組織顏色，平均直徑大小及質(zhì)地情況，篩選出最適分枝列當(dāng)愈傷組織生長的條件。

1.6 蔗糖含量對列當(dāng)組織培樣的影響

以B5+0.7%瓊脂+600 mg/L酸水解酪蛋白(pH5.8)和B5+0.7%瓊脂+600 mg/L水解酪蛋白+1 mg/L IAA+8 mg/L GA3(pH5.8)為基本培養(yǎng)基，分別添加1%、2%、3%的蔗糖，24 ℃暗培養(yǎng)，第4周觀察愈傷組織并統(tǒng)計所形成愈傷組織顏色，平均直徑大小及質(zhì)地情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子處理時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以不同GR24處理天數(shù)的萌發(fā)的列當(dāng)種子作為外植體對列當(dāng)愈傷組織的形成具有一定的影響。在GR24處理4～5 d時為誘導(dǎo)愈傷組織最佳處理時間，更長或更短時間的GR24處理天數(shù)都不利于分枝列當(dāng)愈傷組組織的形成，在GR24處理1～2 d時，種子萌發(fā)率較低，導(dǎo)致愈傷組織產(chǎn)生率較低，盡管在GR24處理5天以上有種子萌發(fā)率較高，但形成芽管較長，且外植體與空氣接觸面積變大，容易污染，因此，也不利于愈傷組織的形成。

圖1 GR24不同處理天數(shù)對分枝列當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 培養(yǎng)基及激素對分枝列當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將GR24處理過的萌發(fā)的分枝列當(dāng)種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，1周左右可在培養(yǎng)基中觀察到白色的列當(dāng)愈傷組織，4周后可觀察到愈傷組織形成，直徑約1.8 cm 左右，且呈現(xiàn)絲狀突起的白色團(tuán)狀物(圖2)。在MS培養(yǎng)基上，形成的團(tuán)狀愈傷組織較B5培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的愈傷組織小(直徑為0.3～0.6 cm)，幾乎無絲狀突起。說明MS中的營養(yǎng)物質(zhì)不適合分枝列當(dāng)?shù)纳L發(fā)育。

添加生長素與細(xì)胞分裂素對植物的愈傷組織誘導(dǎo)有很重要的作用。從表1可知：當(dāng)培養(yǎng)基中加入2，4-D時，形成的愈傷組織較小，含水量較高，極軟易碎，不易成形。GA3的加入有打破種子休眠作用，增加了種子的萌發(fā)率，有利于分枝列當(dāng)愈傷組織的形成。因此，處理5所形成的愈傷組織平均直徑最大，且無褐化現(xiàn)象。所以篩選出誘導(dǎo)分枝列當(dāng)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，所添加激素為IAA為1 mg/L，GA3為8 mg/L。

表1 培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑對分枝列當(dāng)愈傷組織形成的影響

圖2 分枝列當(dāng)四周齡愈傷組織

2.3 蔗糖含量對分枝列當(dāng)分化的影響

蔗糖含量對分枝列當(dāng)花芽的發(fā)育有著非常顯著的影響。從表2可知：在無激素添加條件下，隨著蔗糖濃度的增加，其質(zhì)地由疏松逐漸發(fā)育為致密。在1%蔗糖處理中，幾乎看不到花芽的形成；2%蔗糖含量處理中，分枝列當(dāng)由愈傷組織繼續(xù)分化出花芽的數(shù)量極少。含量在3%的蔗糖濃度中，1周后已長出較長的芽管(圖3A)，2至3周時，出現(xiàn)質(zhì)地較為致密的愈傷組織圖(圖3B、C)，4至5周后可以觀察到分枝列當(dāng)?shù)挠鷤M織質(zhì)地較為堅(jiān)硬，隨后分化出淡黃色的花芽(圖3D、E)。但是在無寄主的情況下，可以明顯觀察到分化出花芽的單個個體至少由2個列當(dāng)種子萌發(fā)后形成的，它們可能會通過相互寄生來繼續(xù)生長(圖3F)。

從表2可以看出：處理4和處理5所形成愈傷組織平均直徑相同，均為1.8 cm，但在處理5中分枝列當(dāng)?shù)幕ㄑ啃纬陕首罡?，且無褐化現(xiàn)象。因此，分枝列當(dāng)愈傷組織分化出花芽的最佳培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，其蔗糖含量為3%，并且無任何激素的添加。

表2 蔗糖含量對分枝列當(dāng)愈傷組織花芽分化形成的影響

3 討論

對寄生性種子植物組織培養(yǎng)和分枝列當(dāng)同科的全寄生植物肉蓯蓉的研究較多，已從荒漠肉蓯蓉的莖、幼芽、鱗片、花瓣、子房、雄蕊和種子等多種組織和器官中誘導(dǎo)得到愈傷組織，同時溫度、培養(yǎng)基、激素配比、pH值、光照和誘導(dǎo)子等對愈傷組織的培養(yǎng)和PhGs的合成都有影響[11]。朱永華等[12]以肉蓯蓉花器、肉質(zhì)莖、幼芽、鱗片、子房等作為外植體的研究發(fā)現(xiàn)，以子房、莖塊作為外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)率高、時間短，且愈傷組織的質(zhì)地較好，最適培養(yǎng)條件為B5+1 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA。吳新等[13]用添加BA、IBA和GA3的B5培養(yǎng)基，用肉蓯蓉肉質(zhì)莖誘導(dǎo)出了愈傷組織。然而，所有的組織培養(yǎng)僅僅停留在誘導(dǎo)出愈傷組織，未有進(jìn)一步的研究文獻(xiàn)，這可能與肉蓯蓉寄生生長的遺傳特性有關(guān)。

由于全寄生種子植物分枝列當(dāng)?shù)纳L發(fā)育相比其他植物較為特殊，其組織培養(yǎng)得到的分化的花芽寄生能力較弱，因此，后續(xù)還需要對誘導(dǎo)出的列當(dāng)如何與甜瓜根部進(jìn)一步共培養(yǎng)進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

以萌發(fā)的分枝列當(dāng)種子為外植體，誘導(dǎo)分枝列當(dāng)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為B5+1 mg/L IAA+8 mg/L GA3+600 mg/L水解絡(luò)蛋白+2%蔗糖+0.7%瓊脂；在無寄主的條件下，通過添加適量的蔗糖，可以由愈傷組織分化出淡黃色的花芽，這對于寄生植物組織培養(yǎng)的研究來說是一個大的進(jìn)步。