彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分型研究進(jìn)展

李喆 岑洪

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院淋巴血液兒童腫瘤內(nèi)科

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）占所有非霍奇金淋巴瘤的25%～35%，是一組具有不同臨床、病理和生物學(xué)特征的異質(zhì)性、侵襲性淋巴瘤[1]。既往臨床研究確定了利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強(qiáng)的松（R-CHOP）作為DLBCL患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，其中50%～70%的患者可以治愈[2-4]，但是也有很大一部分患者表現(xiàn)為難治或完全緩解后復(fù)發(fā)[5]，而只有10%的難治復(fù)發(fā)患者可以通過傳統(tǒng)的挽救免疫化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植治愈[6-7]，其余90%的患者治療結(jié)局不佳。因此，如何改善這部分患者的預(yù)后成為面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前臨床上也有研究探討在R-CHOP基礎(chǔ)上聯(lián)合其他藥物（如聯(lián)合來那度胺、伊布替尼等）來進(jìn)一步提高療效，但未取得明顯進(jìn)展。DLBCL具有顯著異質(zhì)性，因此如何進(jìn)行精確分層診斷以及指導(dǎo)個體化治療也是目前的研究熱點之一。本文就DLBCL分型的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 利用基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行DLBCL的COO分型

DLBCL在細(xì)胞形態(tài)和預(yù)后上呈明顯異質(zhì)性，2000年，ALIZADEH等[8]應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出在淋巴細(xì)胞發(fā)育分化及致癌過程中起重要作用的3 186個基因并進(jìn)行檢測，繪制了DLBCL基因表達(dá)譜（gene expression profile，GEP），發(fā)現(xiàn)DLBCL起源于不同分化階段的B淋巴細(xì)胞。而根據(jù)GEP可以將DLBCL分為生發(fā)中心樣（germinal center B cell like，GCB）型和活動B細(xì)胞樣（activated B cell like，ABC）型兩種亞型。隨后ROSENWALD等[9]研究也證實了這一結(jié)果。后續(xù)有研究通過納入更多病例和更多種類的基因篩選，發(fā)現(xiàn)部分患者無法確定細(xì)胞來源，其特征界于兩種亞型之間，被命名為第3型，亦稱為未分類型[10-11]。而對于不同起源的DLBCL，研究發(fā)現(xiàn)其顯示出不同的預(yù)后，其中GCB來源的DLBCL可以獲得更長的生存時間[12]。細(xì)胞起源（COO）分型揭示了DLBCL的異質(zhì)性，在R-CHOP治療下，各亞型間具有顯著的生存差異，為評估預(yù)后和方案選擇奠定理論依據(jù)。基于基因芯片技術(shù)的GEP檢測結(jié)果目前被公認(rèn)為判斷DLBCL細(xì)胞起源的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果最可靠，但費(fèi)用昂貴，對標(biāo)本要求高，通常需要新鮮冰凍的活體組織標(biāo)本，因此可操作性不強(qiáng)，臨床并未廣泛采用。

2 利用NanoString技術(shù)進(jìn)行DLBCL的COO分型

NanoString（熒光條形碼標(biāo)記的單分子檢測）是一種全新的高通量檢測基因表達(dá)譜技術(shù)，基于核酸分子與探針雜交后，對探針上的熒光分子條形碼進(jìn)行直接測量。每個條形碼標(biāo)記對應(yīng)某一特異mRNA序列，在同一樣本中最高可以測量800個條形碼，而所需的樣本量可以低至100 ng RNA。NanoString的數(shù)字化定量技術(shù)無需轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增或者文庫構(gòu)建，省去了冗長的實驗程序和人力資源，也最大程度地降低了由酶促反應(yīng)帶來的潛在偏差[13]。對于樣本量稀少的臨床樣本，NanoString技術(shù)可以不經(jīng)過RNA提取，直接利用石蠟包埋樣本對RNA進(jìn)行定量，這種技術(shù)優(yōu)勢使其在臨床上具有更好的實用性。SCOTT等[14]根據(jù)GEP分型的數(shù)據(jù)篩選出20個基因，采用NanoString技術(shù)對119例DLBCL樣本進(jìn)行COO分型，研究結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”的一致性達(dá)到95%，也可以將患者分為GCB型、ABC型和未分類型，后兩者統(tǒng)稱為non-GCB型，其中同樣顯示GCB型預(yù)后優(yōu)于non-GCB型。其他基于NanoString技術(shù)進(jìn)行的研究也進(jìn)一步證實了該技術(shù)在DLBCL的COO分型中的價值[15-17]。

3 利用定量PCR技術(shù)進(jìn)行DLBCL的COO分型

基因芯片分型和NanoString分型都需要昂貴的特殊儀器設(shè)備，難以在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。定量PCR是用于驗證基因表達(dá)量的常用方法，具有操作簡單、靈敏度和精確度高，可從石蠟包埋獲取標(biāo)本等特點。李小秋團(tuán)隊首次采用定量PCR的方法在中國患者人群中進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗證，開發(fā)了一款適用于臨床開展基因檢測的產(chǎn)品，即 DLBCL-COO Assay[18]。該研究通過公共數(shù)據(jù)庫中篩選32個與DLBCL-COO分型顯著相關(guān)的基因，入組160例患者，然后采用免疫組化、定量PCR和基因芯片的方法分別檢測其石蠟包埋標(biāo)本及相應(yīng)的新鮮組織標(biāo)本，結(jié)果顯示DLBCLCOO Assay分型結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”一致性達(dá)到92%；生存分析顯示DLBCL-COO Assay的分型結(jié)果與總生存顯著相關(guān)，GCB型預(yù)后顯著優(yōu)于ABC型（P=0.023），與國內(nèi)外研究[12]結(jié)果高度一致。相對而言，利用定量PCR技術(shù)進(jìn)行分型的方法平臺更開放，操作更簡單，適用于廣大分子病理實驗室常規(guī)開展。

4 利用免疫組化技術(shù)進(jìn)行DLBCL的COO分型

對于一些資金和技術(shù)比較匱乏的地區(qū)，基于GEP的分型技術(shù)難以廣泛應(yīng)用，因此目前臨床上使用最廣泛的仍是基于免疫組化（immunohistochemistry，IHC）的分型方法。2005年，HANS等[19]應(yīng)用組織芯片技術(shù)進(jìn)行分型，通過檢測CD10、BCL6、MUM-1建立了IHC的分型模式，可以將DLBCL分為GCB型和non-GCB型，前者預(yù)后顯著優(yōu)于后者（P＜0.001），該分型方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性為84%。為進(jìn)一步提高預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性，后續(xù)又相繼提出了新的型分型系統(tǒng)，如Choi、Tally等。

Choi分型基于 CD10、BCL6、MUM-1、FOXP1和GCET1等5種生物標(biāo)志建立，在Hans分型法基礎(chǔ)上增加了FOXP1和GCET1兩種標(biāo)志物，與“金標(biāo)準(zhǔn)”的一致性達(dá)93%[20]。既往研究顯示FOXP1在ABC型中高表達(dá)[21]，且高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[22]，當(dāng)FOXP1取臨界值為80%時可以特異性地區(qū)分ABC型DLBCL[20]。而GCET1高度局限表達(dá)于生發(fā)中心來源的B細(xì)胞，因此在Hans分型基礎(chǔ)上加入GCET1有助于鑒別GCB型和 ABC 型的 DLBCL[23-24]。在預(yù)測預(yù)后方面，采用Choi分型預(yù)測患者3年生存率，其中GCB型為88%，ABC型為44%，與“金標(biāo)準(zhǔn)”GEP分型的預(yù)測結(jié)果（GCB型為92%，ABC型為44%）相當(dāng)接近[20]。李敏等[25]對比Choi分型與Hans分型的預(yù)測能力，同樣顯示前者更精確，其中Hans分型下GCB組和non-GCB組患者的總生存表現(xiàn)為無明顯差異（P=0.102），而Choi分型中GCB組預(yù)后表現(xiàn)明顯優(yōu)于non-GCB組（3年生存率分別為61.8%和42.5%，P＜0.05）。然而值得注意的是，近年來隨著不同研究中心發(fā)現(xiàn)BCL6具有高度不一致性，因此在Choi和Hans的改良分型中都取消納入BCL6，結(jié)果顯示兩者的預(yù)測效能有所減弱，但更易于臨床操作和結(jié)果判讀[26-27]。

如前所述可知，基于IHC的Hans分型和Choi分型具有相似的功能，對若干個抗體的結(jié)果按一定的順序進(jìn)行判斷，導(dǎo)致某些抗體比其他抗體具有更高的優(yōu)先級，這些分型方法允許在滿足前面條件的情況下排除后面的抗體結(jié)果。然而，GEP分型并不按照一定的順序或排除某些結(jié)果，為了減少這類分歧，MEYER等[26]開發(fā)了一種不按照特定順序?qū)贵w結(jié)果進(jìn)行判斷的分型方法，即Tally分型法，其與“金標(biāo)準(zhǔn)”的一致性最高，為93%，而Hans和Choi分型法均為87%。Tally分型法包括等量的GCB（GCET1和CD10）和ABC（FOXP1和MUM-1）抗體，分類由抗原陽性較多的免疫表型對決定。每種類型都使用兩種抗體，因此在每種類型陽性結(jié)果相同的情況下，需要用LMO2確定免疫表型（LMO2≥30%為臨界值）。已有研究證實LMO2在GCB來源的B淋巴細(xì)胞或淋巴瘤特異性表達(dá)，且其高表達(dá)與DLBCL預(yù)后良好顯著相關(guān)[28]。

綜上認(rèn)為，基于IHC的DLBCL的COO分型方法雖然不如NanoString分型和定量PCR分型，但與“金標(biāo)準(zhǔn)”的一致性也達(dá)到74%～93%[26]，具有操作簡單、價格便宜和對標(biāo)本要求不高等優(yōu)點，便于各醫(yī)院常規(guī)開展。其中Choi和Tally分型法與“金標(biāo)準(zhǔn)”的一致性更高，但是GCET1、FOXP1和LMO2不是常備抗體，一定程度上限制了廣泛應(yīng)用。

5 基于基因突變的DLBCL分型探索

幾乎所有的DLBCL患者均存在基因突變，具有某些突變的患者，特定的靶向藥物療效可能受影響從而影響預(yù)后。因此，基于突變特征的DLBCL亞型分析具有臨床實用價值。SCHMITZ等[29]選取了574例DLBCL患者的新鮮冰凍標(biāo)本，采用外顯子和轉(zhuǎn)錄組測序，對基因芯片的DNA拷貝數(shù)進(jìn)行分析，其中選取372個基因進(jìn)行靶向擴(kuò)增重測序，以識別具有重現(xiàn)性突變的基因。研究結(jié)果將DLBCL分為4個基因型：MCD型（主要為MYD88L265P和CD79B共突變）、BN2型（主要為BCL6融合和NOTCH2突變）、N1型（主要為NOTCH1突變）和EZB型（主要為EZH2突變和BCL2易位），其中MCD和N1型主要為起源于ABC的患者，EZB型主要為起源于GCB的患者，BN2型在ABC型、GCB型和未分類型的患者中分別占一定比例（GCB型占19%，ABC型占41%，未分類型占40%）。該研究還發(fā)現(xiàn)新的基因分型能較好地判斷預(yù)后，其中BN2和EZB型預(yù)后優(yōu)于MCD和N1型，MCD、N1、BN2和EZB型預(yù)測5年生存率分別為26%、36%、65%、68%，多因素分析也顯示新的基因分型是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，且不受IPI評分影響。該研究小組創(chuàng)建了LymphGen算法[30]，在此前研究基礎(chǔ)上將DLBCL分為7個基因型，新增了A53型（伴有TP53失活）、ST2型（伴有SGK1和TET2突變）和其他不能分類，該分型方法可以明確63.1%的DLBCL基因亞型。其中ABC型中BN2亞型預(yù)后最好，GCB型中ST2亞型預(yù)后好于EZB亞型。因此認(rèn)為，新的基因分型進(jìn)一步揭示了DLBCL的發(fā)病機(jī)制，各亞型之間具有不同的發(fā)病機(jī)制，不同基因亞型對免疫化療的反應(yīng)也不同，而這可能影響靶向治療的選擇，但是該分型方法的最大局限性是一部分的患者無法歸入任何一個亞型，有關(guān)方面值得深入研究。

CHAPUY等[31]通過對304例DLBCL患者進(jìn)行全外顯子測序，獲取低頻突變、復(fù)發(fā)突變、體細(xì)胞拷貝數(shù)變化和結(jié)構(gòu)變異的相關(guān)數(shù)據(jù)，從而將患者定義為5個基因型：C1型（主要為 BCL10、TNFAIP3、UBE2A、CD70突變和BCL6易位，多為ABC來源）、C2型（存在TP53雙等位基因失活，影響染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞周期，與ABC/GCB來源無關(guān)）、C3型（主要為BCL2、CREBBP2、EZH2、KMT2D、TNFRSF14突變，主要為GCB來源）、C4型（主要為SGK1、HIST1H1E、NFKBIE、BRAF和CD83突變，多為GCB來源）、C5型（主要為CD79B、MYD88L265P、ETV6、PIM1和TBL1XR1突變，多為ABC來源，原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及睪丸DLBCL在此類型中常見）和C0型（缺乏明確的遺傳驅(qū)動因素）。該研究還進(jìn)一步分析新基因分型與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示C0、C1和C4型預(yù)后較好，而C3和C5型預(yù)后較差，其中ABC來源的患者中C1型患者預(yù)后明顯優(yōu)于C5型，而GCB來源的患者中C4型明顯優(yōu)于C3型。新的基因分型還定義了低風(fēng)險的ABC型DLBCL（C1型），其細(xì)胞可能起源于濾泡外邊緣區(qū)；高風(fēng)險的GCB型DLBCL伴有BCL2結(jié)構(gòu)變異以及PETN和表觀遺傳學(xué)酶的改變（C3型），而低風(fēng)險的GCB型DLBCL伴有多條通路（BCR/PI3K、JAK/STAT、BRAF）激酶和多重組蛋白的改變（C4型）；與ABC/GCB起源無關(guān)的分型伴有TP53雙等位基因失活，9p21.3/CDKN2A和相關(guān)基因的不穩(wěn)定性（C2型）。這些DLBCL的關(guān)鍵遺傳學(xué)特征包括突變、體細(xì)胞拷貝數(shù)變化和結(jié)構(gòu)變異，而通過獲取這三類遺傳信息的改變可用于解釋疾病和治療結(jié)局的差異性。

LACY等[32]基于對293個基因的靶向測序分析928例DLBCL患者的基因突變特征，將患者分為5個亞型：MYD88型（以MYD88L265P、PIM1、CD79B突變?yōu)橹?，主要為ABC來源，多數(shù)原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸和乳腺的DLBCL患者屬于此亞型）；BCL2型（以EZH2、BCL2、CREBBP、TNFRSF14、KMT2D和MEF2B的突變?yōu)橹?，主要為GCB來源，部分高級別淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤轉(zhuǎn)化的DLBCL患者屬于此型）；SOCS1/SGK1型（主要包括SOCS1、CD83、SGK1、NFKBIA、HIST1H1E和STAT3突變，以GCB來源為主，多數(shù)原發(fā)縱膈DLBCL屬于此型）；TET2/SGK1型（主要包括TET2、SGK1、KLHL6、ZFP36L1、BRAF、MAP2K1和 KRAS突變，以GCB來源為主）；NOTCH2型（主要包括NOTCH2、BCL10、TNFAIP3、CCND3、SPEN、TMEM30A FAS 和CD70突變，由ABC、GCB和未分類來源共同組成，與邊緣區(qū)淋巴瘤具有相似的特征）；未分類亞型（not elsewhere classified，NEC）。該研究分析了不同基因分型與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示MYD88型預(yù)后最差，5年生存率為42%；BCL2、SOCS1/SGK1和TET2/SGK1型預(yù)后良好，5年生存率分別為64.9%、62.5%、60.1%；而NOTCH2和NEC型的預(yù)后界于兩者之間，5年生存率分別為48.1%、53.6%。

綜上可見，3種分型系統(tǒng)既有區(qū)別，也有部分內(nèi)容重疊。其中MYD88、C5和MCD型均與ABC來源相關(guān)，原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和睪丸淋巴瘤多發(fā)生在這3種分型中，且預(yù)后不良。C2型以TP53突變/缺失為特征，多數(shù)預(yù)后不佳，A53對應(yīng)于C2。BCL2、C3和EZB型與GCB來源相關(guān)，突變特征與濾泡性淋巴瘤相同，盡管雙打擊和高級別淋巴瘤好發(fā)于此型，但總體預(yù)后良好。而SOCS1/SGK1和C4型主要為GCB來源DLBCL，與原發(fā)縱膈大B細(xì)胞淋巴瘤的遺傳特征相似，預(yù)后最好。但是目前的突變分型較復(fù)雜，不同研究的方法和結(jié)果不盡相同，因此未來仍需簡化分析流程，進(jìn)一步明確核心突變基因?qū)︻A(yù)后和治療的影響。

6 小結(jié)

基于GEP的COO分型是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是對標(biāo)本要求高，費(fèi)用昂貴，不易于臨床常規(guī)開展。作為替代方案，基于NanoString、定量PCR和免疫組化技術(shù)的COO分型，雖然在標(biāo)本要求、技術(shù)難度和實驗費(fèi)用等方面進(jìn)一步優(yōu)化，但預(yù)后判斷準(zhǔn)確性及指導(dǎo)治療的作用與金標(biāo)準(zhǔn)相比仍有一定差距。目前研究也顯示，幾乎所有DLBCL患者含有基因突變，而不良的基因突變可顯著影響預(yù)后，某些特定突變的靶向治療也可能改善預(yù)后，因此基于基因突變的新分型具有重要的臨床意義?；蛲蛔兎中褪菍OO分型的補(bǔ)充，解釋了同一COO亞型中也存在顯著異質(zhì)性。但是基因突變分型不能包含所有患者，對臨床預(yù)后的指導(dǎo)意義以及目前使用的傳統(tǒng)藥物和新型靶向藥物是否能通過該分型指導(dǎo)治療仍需加進(jìn)一步研究證實。