銅藍(lán)蛋白與惡性腫瘤

秦倩 秘嘉慶 馮勤梅

作者單位：030012 太原 山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病，治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療等，此外免疫治療、分子靶向治療近年來快速發(fā)展并取得一定成效，為惡性腫瘤的治療帶來了曙光。為此，學(xué)者們不斷探索更有效的治療靶點(diǎn)，以進(jìn)一步提高患者生存率。銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin，Cp）又稱鐵氧化酶，是一種含銅的α-2球蛋白，具有氧化酶活性。Cp參與了人體內(nèi)許多重要的生理活動(dòng)，在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及鐵穩(wěn)態(tài)中起重要作用。Cp作為一種急性期反應(yīng)蛋白，在感染、創(chuàng)傷、冠心病患者及妊娠婦女中表達(dá)增加[1-2]。在腫瘤中，Cp被認(rèn)為是潛在的致癌因子，其中在肺癌[3]、卵巢癌[4]、肝癌[5]等多種腫瘤中異常表達(dá)，且可通過調(diào)節(jié)鐵死亡、血管生成和影響腫瘤微環(huán)境而參與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。本文就Cp與惡性腫瘤的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Cp的結(jié)構(gòu)及組織分布

Cp為多銅氧化酶家族的一員，含有95%以上的血漿銅[6]，其單鏈由1 046個(gè)氨基酸組成，是一種可結(jié)合6個(gè)銅離子的α-2球蛋白。在正常人體內(nèi)，Cp主要由肝細(xì)胞合成，銅在腸道內(nèi)以銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ctr1）依賴的方式吸收后經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟，而肝細(xì)胞中的ATP7B酶在跨高爾基網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中將銅離子結(jié)合到無銅Cp（即無活性Cp），進(jìn)而形成有功能的Cp（即功能型Cp），并分泌到膽汁或血液中[7]。Cp除了在肝細(xì)胞中合成外，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也可在炎癥因子的誘導(dǎo)下表達(dá)Cp[8]。Cp主要有兩種亞型：分泌型（sCp）和膜結(jié)合型糖基磷脂酰肌醇錨定型（GPI-Cp）。sCp主要來源于肝臟，包括無活性Cp和功能型Cp兩種形式，其中功能型Cp是人體內(nèi)循環(huán)中Cp的主要形式，半衰期約為5.5 d，而無活性Cp半衰期約為5 h[9]。GPI-Cp通過選擇性剪接sCp產(chǎn)生，剪接發(fā)生在外顯子18的下游，sCp C末端的5個(gè)氨基酸由30個(gè)選擇性氨基酸殘基取代，增加糖基磷脂酰肌醇錨定性，主要在腦細(xì)胞及睪丸細(xì)胞中表達(dá)[10]。

2 Cp在惡性腫瘤進(jìn)展中的作用

目前研究發(fā)現(xiàn)Cp在體內(nèi)主要通過調(diào)節(jié)鐵死亡、血管生成和影響腫瘤微環(huán)境參與腫瘤進(jìn)展。銅是多種血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)（如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、VEGF-A），也是腫瘤微環(huán)境成分發(fā)揮功能必需的輔助因子，而Cp可作為銅離子載體，能調(diào)節(jié)銅離子在體內(nèi)的分布[11]。鐵氧化是Cp的另一種重要功能，Cp可利用銅將電子轉(zhuǎn)移到氧，使Fe2+氧化為Fe3+，進(jìn)而與轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞，從而為細(xì)胞增殖提供充足的鐵[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）表達(dá)增加時(shí)，鐵以TF-[Fe3+]2-TFR1復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞溶酶體，并在溶酶體酸性條件下釋放出Fe3+，而Fe3+在鐵還原酶STEAP3的作用下可還原為Fe2+，進(jìn)而釋放到細(xì)胞質(zhì)，使Fe2+在細(xì)胞內(nèi)蓄積，并進(jìn)一步通過芬頓反應(yīng)參與體內(nèi)活性氧的形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；此外在肺癌、肝癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中Cp表達(dá)增加，可利用銅將電子轉(zhuǎn)移到氧，使Fe2+氧化為Fe3+，減少細(xì)胞內(nèi)的Fe2+，進(jìn)而抑制鐵死亡[13]。由此可見，腫瘤細(xì)胞中Cp高表達(dá)可抑制鐵死亡，進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞死亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。此外，Cp還可通過缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）促進(jìn)血管生成。有研究顯示，快速增長(zhǎng)的腫瘤因缺氧反應(yīng)性的激活由α亞單位和β亞單位組成的異二聚體-HIF的表達(dá)[14]，而介導(dǎo)其α亞單位降解的結(jié)構(gòu)域含有特定的脯氨酸殘基，可被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化[15]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中Cp含量增加時(shí)，PHD的輔因子Fe2+含量下降，進(jìn)而減弱PHD對(duì)HIF-α（HIF-1α和HIF-2α）羥基化作用，減少HIF降解[16]，同時(shí)HIF-1α與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的啟動(dòng)子結(jié)合，可進(jìn)一步上調(diào)VEGF表達(dá)[15，17-18]，而VEGF可結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體觸發(fā)導(dǎo)致血管生成的酪氨酸激酶途徑，從而促進(jìn)血管生成[19]。

2.1 Cp與肺癌

目前的研究顯示，Cp在肺癌中高表達(dá)且與患者預(yù)后不良相關(guān)，并可能通過促進(jìn)血管生成導(dǎo)致肺癌進(jìn)展，是肺癌潛在的治療靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物。CHEN等[3]通過生物信息學(xué)分析141例肺腺癌患者及191例正常對(duì)照組患者，發(fā)現(xiàn)1 238個(gè)差異表達(dá)基因中，Cp作為一種上調(diào)表達(dá)基因在肺腺癌的發(fā)展中起作用。SUN等[20]通過表達(dá)陣列篩選敲除肺腫瘤抑制基因GPRC5A和野生型小鼠的上調(diào)基因，作為前20個(gè)上調(diào)基因之一的Cp可能參與GPRC5A缺乏的腫瘤發(fā)生，同時(shí)通過搜集數(shù)據(jù)庫Oncomine中的信息發(fā)現(xiàn)肺癌患者中GPRC5A表達(dá)下調(diào)且Cp表達(dá)上調(diào)，推測(cè)GPRC5A可能調(diào)節(jié)Cp表達(dá)。該研究進(jìn)一步通過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Cp在非小細(xì)胞肺癌組織及大多數(shù)肺癌細(xì)胞系（如HCC827、H1792、H1975和H661）中呈高表達(dá)，且其在敲除肺腫瘤抑制基因GPRC5A的肺癌小鼠模型中表達(dá)增加，而GPRC5A重新表達(dá)后，Cp表達(dá)降低，提示Cp在肺癌中發(fā)揮的作用可能與GPRC5A有關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，Cp在GPRC5A敲除小鼠肺上皮細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但在肺癌細(xì)胞系H1299和H661中過表達(dá)GPRC5A后，Cp并未受到抑制，表明由GPRC5A缺陷引起的Cp上調(diào)表達(dá)可能發(fā)生在正常肺上皮細(xì)胞或早期肺腫瘤組織中，隨著腫瘤發(fā)展，表觀遺傳學(xué)改變，抑制了GPRC5A過表達(dá)對(duì)Cp表達(dá)的抑制效應(yīng)，Cp可能與肺腫瘤發(fā)生的過程有關(guān)。而TSAI等[16]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較7組肺腺癌組織及正常肺組織中Cp表達(dá)情況，結(jié)果顯示其中4組肺腺癌組織的Cp mRNA含量較正常肺組織增加，分析Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫中7個(gè)數(shù)據(jù)集亦發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中Cp mRNA較正常肺組織中含量增加；進(jìn)一步通過RNA測(cè)序及miRwalk 2.0網(wǎng)站分析，發(fā)現(xiàn)在肺癌中miR-145-5p（腫瘤抑制因子）與Cp mRNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合，從而抑制Cp表達(dá)。還有研究報(bào)道，HIF作為Cp的靶基因，在多種腫瘤生長(zhǎng)中起促進(jìn)作用[15]。HIF-α羥基化受PHD調(diào)節(jié)，當(dāng)Cp含量增加時(shí)，F(xiàn)e2+含量下降，從而減弱PHD對(duì)HIF-α羥基化作用，進(jìn)而增加HIF活性，上調(diào)VEGF-A表達(dá)[18]。由此推測(cè)肺腺癌細(xì)胞可能通過miR-145-5p→Cp→PHD1/2→HIF-2α→VEGF-A信號(hào)通路促進(jìn)血管生成，影響腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

關(guān)于Cp與肺癌預(yù)后的關(guān)系，TSAI等[16]分析GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE31210數(shù)據(jù)集，結(jié)果顯示Ⅱ期肺癌患者癌組織中Cp的表達(dá)較Ⅰ期患者高，且其高表達(dá)與較短的生存期相關(guān)（HR=1.4，P=0.023）。MATSUOKA等[21]研究亦發(fā)現(xiàn)Cp與肺癌的侵襲性和預(yù)后顯著相關(guān)，Cp在浸潤(rùn)型肺癌組織中的表達(dá)率（54.3%）明顯高于微小浸潤(rùn)型腺癌（16.7%）和原位腺癌（0.5%）（P＜0.01），且微小浸潤(rùn)型腺癌高于原位腺癌（P＜0.01）；Cox回歸模型分析顯示Cp高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)高于低表達(dá)患者（HR=1.642，95%CI：1.050～2.568）。同時(shí)，該研究還觀察到Cp不僅在癌細(xì)胞中表達(dá)，在肺泡腔中也可見染色，在肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清中含量明顯高于細(xì)胞裂解液，可能是由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的Cp完全分泌到培養(yǎng)基中，因此認(rèn)為肺癌細(xì)胞表達(dá)sCp，分泌進(jìn)入腫瘤微環(huán)境發(fā)揮促進(jìn)血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

2.2 Cp與卵巢癌

卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，且復(fù)發(fā)患者易產(chǎn)生化療耐藥[22]，預(yù)后極差。近年來靶向治療（如PARP抑制劑）在卵巢癌的治療中取得了突破性進(jìn)展[19]，因此不斷尋找更有效的治療靶點(diǎn)尤為迫切。目前研究顯示Cp在卵巢癌中具有一定應(yīng)用前景，如TRIFANESCU等[4]通過分光光度法分析顯示Cp在卵巢癌患者血清中較正常值明顯增加。腹水可作為發(fā)現(xiàn)卵巢癌生物標(biāo)志物更好的介質(zhì)，MIYAMOTO等[23]進(jìn)一步利用腹水代替血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示Cp在卵巢癌患者腹水中含量較對(duì)照組血清豐富，提示卵巢癌細(xì)胞可能通過分泌Cp進(jìn)入腹水，發(fā)揮促卵巢癌進(jìn)展的作用。DAI等[24]研究亦顯示癌基因LINC00176可通過募集轉(zhuǎn)錄因子BCL3上調(diào)Cp表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及抑制細(xì)胞凋亡的作用，LINC00176/BCL3/Cp軸為研究卵巢癌的發(fā)生及尋找治療靶點(diǎn)提供了思路。Cp還與卵巢癌患者化療耐藥密切相關(guān)，影響患者的預(yù)后。卵巢癌患者經(jīng)手術(shù)聯(lián)合化療治療后，可使大部分患者獲得完全緩解，但超過70%的晚期上皮性卵巢癌患者在疾病穩(wěn)定（完全或部分緩解）后復(fù)發(fā)，常常伴有化療耐藥，隨著復(fù)發(fā)次數(shù)的增加，無鉑間期縮短、化療效果變差，患者疾病進(jìn)展、最終死亡。HUANG等[25]研究顯示Cp在化療敏感的卵巢癌患者腹水中的平均濃度顯著低于固有化療耐藥患者（157.5 mg/mLvs192.2 mg/mL，P=0.001）。鉑耐藥卵巢癌患者口服降銅劑降低Cp后，可增強(qiáng)Ctr1功能，促進(jìn)卡鉑進(jìn)入卵巢癌細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性，使患者對(duì)卡鉑再次敏感[26]。TRIFANESCU等[4]監(jiān)測(cè)35例卵巢癌患者術(shù)后4個(gè)療程鉑化療后血清中Cp的水平，發(fā)現(xiàn)其平均水平由169.6 UI降低至139.0 UI。以上研究提示，較高的Cp水平與卵巢癌患者化療耐藥相關(guān)，Cp可能是卵巢癌患者預(yù)后不良和化療耐藥的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

2.3 Cp與乳腺癌

乳腺癌具有多器官轉(zhuǎn)移特性，研究表明Cp在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)[27]。銅是腫瘤進(jìn)展的必須成分，大量臨床前模型研究顯示銅可上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是重塑腫瘤和肺轉(zhuǎn)移前微生態(tài)關(guān)鍵酶如賴氨酰氧化酶（LOX）、過氧化物歧化酶-1、血管黏附蛋白-1的重要組成成分；而銅缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、血管形成、腫瘤增長(zhǎng)及侵襲性下降，使腫瘤進(jìn)入休眠狀態(tài)[28-29]。乳腺癌轉(zhuǎn)移所需的微環(huán)境也需要足夠的銅參與，而Cp作為銅的主要載體，可能為腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供有利條件。CHAN等[30]分析75例口服四硫代鉬酸鹽（銅螯合劑）乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)Cp水平下降至5～17 mg/dL（銅耗竭定義為Cp＜17 mg/dL）后進(jìn)入維持治療階段，且內(nèi)皮祖細(xì)胞（血管生成開關(guān)）和賴氨酰氧化酶樣蛋白2等含量明顯下降（P=0.002；P＜0.001）；在乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)四硫代鉬酸鹽處理后Cp水平降低的小鼠轉(zhuǎn)移前肺中的LOX和膠原沉積均減少（P=0.03；P=0.01），繼發(fā)性肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率亦下降（P=0.04），而補(bǔ)充銅含量后可挽救LOX活性，表明LOX活性的喪失可能由四硫代鉬酸鹽消耗銅所致，Cp可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，GANGODA等[27]利用TMHMM蛋白跨膜結(jié)構(gòu)工具分析發(fā)現(xiàn)，具有高轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌細(xì)胞株的外泌體中富集的Cp是非轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的19～31倍，可見乳腺癌細(xì)胞可以分泌Cp，且Cp的含量可能反應(yīng)了腫瘤進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。KRZYMINIEWSKI等[31]也報(bào)道Cp含量隨放療次數(shù)的增加而下降，認(rèn)為Cp是監(jiān)測(cè)乳腺癌患者放療反應(yīng)的潛在標(biāo)志物。

2.4 Cp與消化系統(tǒng)腫瘤

在消化系統(tǒng)腫瘤中，Cp可通過調(diào)節(jié)鐵死亡及血管生成參與其發(fā)生發(fā)展，因此靶向Cp的抗腫瘤藥物可能成為新的治療策略。SHANG等[5]報(bào)道在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中抑制Cp表達(dá)可導(dǎo)致Fe2+在細(xì)胞內(nèi)蓄積，促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡；而過表達(dá)Cp則抑制肝癌細(xì)胞鐵死亡，提示Cp在肝細(xì)胞癌細(xì)胞鐵死亡中起關(guān)鍵作用，以Cp為靶點(diǎn)誘導(dǎo)鐵死亡可能是肝癌新的治療策略。在結(jié)腸癌中，DAI等[32]在體外結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Cp表達(dá)被SARI（腫瘤生長(zhǎng)抑制劑）抑制后，HIF-1a/VEGF軸活性及VEGF表達(dá)和血管生成隨之受抑制；體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，SARI敲除的小鼠腫瘤組織中Cp、HIF-1α、VEGF表達(dá)均較野生型小鼠增加（P＜0.01），推測(cè)SARI可能通過誘導(dǎo)Cp蛋白降解，抑制HIF-1α/VEGF軸活性，減少VEGF表達(dá)，從而抑制血管生成及結(jié)腸癌進(jìn)展。此外，還有研究[33]通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)膽管癌T、N分期晚期和神經(jīng)侵襲性膽管癌組織中Cp表達(dá)增高（P＜0.05），且Cp高表達(dá)患者的中位生存期較Cp低表達(dá)患者短（27.5個(gè)月vs46.1個(gè)月，P=0.307）。SERBANESCU等[34]發(fā)現(xiàn)放化療前直腸癌患者血清中的Cp含量較正常者高，放化療開始時(shí)，Cp含量有所下降，但是隨著放化療進(jìn)行Cp含量增加，其原因可能與治療引起氧化應(yīng)激有關(guān)。

2.5 Cp與其他惡性腫瘤

除上述腫瘤外，還有研究發(fā)現(xiàn)Cp與腎細(xì)胞癌和口腔惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如BLEU等[35]基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)Cp在腎細(xì)胞癌中過表達(dá)，且Cp高表達(dá)患者的生存率顯著降低；而腎細(xì)胞癌中的PAX8（候選致癌基因）可通過控制遠(yuǎn)端增強(qiáng)子（如e-Cp）活性激活Cp基因表達(dá)，影響間質(zhì)細(xì)胞交聯(lián)及血管形成；體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PAX8低表達(dá)時(shí)Cp表達(dá)也顯著減少，可見PAX8可能通過調(diào)節(jié)靶基因Cp表達(dá)發(fā)揮致癌作用。在口腔疾病的研究中，SHAH等[36]通過半自動(dòng)免疫比濁法分析口腔白斑、口腔粘膜下纖維化、煙酸口炎、口腔惡性腫瘤、吸煙或嚼檳榔但無口腔病變和健康對(duì)照組共6組患者血清中Cp的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Cp在口腔惡性腫瘤中的表達(dá)較無口腔病變組顯著增加（P＜0.001），且Cp表達(dá)水平隨病情加重而升高，提示Cp可能與口腔惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)口腔癌前病變惡變的生物標(biāo)志物。

3 小結(jié)

綜上所述，Cp在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，可能通過調(diào)節(jié)鐵死亡、血管生成和影響腫瘤微環(huán)境而參與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，且與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，可能是潛在的致癌因子。因此，未來以Cp靶點(diǎn)誘導(dǎo)鐵死亡，抑制血管生成或者調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境可能是惡性腫瘤潛在的新的治療策略。但目前Cp在惡性腫瘤中的作用研究較少，且主要集中在動(dòng)物模型及腫瘤細(xì)胞系研究，因此未來尚需更深入的探索，進(jìn)一步明確其與惡性腫瘤的關(guān)系，為惡性腫瘤的診療及預(yù)后評(píng)估提供新的分子標(biāo)志物。