沖服水溫對三七粉散瘀止血作用的影響

孫學勤，梁 笑，桂雙英*

沖服水溫對三七粉散瘀止血作用的影響

孫學勤1，梁 笑2，桂雙英2*

(1. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，合肥 230031；2. 安徽中醫(yī)藥大學，合肥 230012)

三七粉（powder，PNP）“散瘀止血”功效明確，臨床上多以水沖服。為探究沖服水溫對三七粉散瘀止血作用的影響，為患者服用三七粉提供一定參考，分別采用細菌內(nèi)毒素（LPS）與角叉菜膠（Ca）制備血瘀證模型，機械損傷建立大鼠外傷出血模型，測定全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)和凝血4項（PT、APTT、Fib和TT）等血流變和凝血指標；測定TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子水平；測定出血時間（BT）和凝血時間（CT）等止血指標，來評價不同溫度（30、40、50和100 ℃）水沖服對三七粉散瘀、止血作用的影響。結(jié)果顯示，三七粉可改變SD大鼠血液流變學行為，降低血液黏度，抑制血栓形成。水浴溫度對三七粉的散瘀作用具有顯著影響，在一定溫度范圍（30 ～ 40 ℃）內(nèi)可顯著降低血瘀證大鼠全血黏度和正常大鼠血漿黏度，改善血液流變特性。

三七；沖服水溫；散瘀；止血

三七為五加科植物三七(Burk.) F. H. Chen 的干燥根和根莖，是我國名貴藥材，具有散瘀止血，消腫定痛之功效，主治咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛和跌撲腫痛[1]。臨床多以研末處理，三七粉為2020版《中國藥典》（一部）三七項下唯一飲片形式，內(nèi)用或外用皆可?！侗静菥V目》記載：赤痢血痢，三七三錢研末，米泔水調(diào)服即愈。大腸下血，三七研末，同淡白酒調(diào)一二錢，服三服可愈[2]。三七除藥用外，還被廣泛用于養(yǎng)生保健。原國家衛(wèi)生部于2002年將三七列入“可用于保健食品的物品名單”（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002] 51號），1994年美國“膳食補充健康和教育法”，將三七和含三七類產(chǎn)品歸類為膳食補充劑[3]。據(jù)調(diào)查，目前有很多人日常自行服用三七粉養(yǎng)生保健，我國三七需求量逐年遞增。伴隨三七粉的熱銷，隨之而來的問題是如何服用三七粉更合適。

三七中含有大量淀粉粒。研究發(fā)現(xiàn)一些含較多淀粉粒的中藥（如貝母），沖服水溫對其活性成分溶出行為有較大的影響，隨著水溫升高、淀粉粒發(fā)生糊化形成致密層，使得水分子難以進入藥材內(nèi)部，有效成分難以溶出[4-5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)不同溫度（30、40、50和100 ℃）水沖懸后的三七粉有效成分溶出速率不同[6]，在此基礎上，本研究分別采用細菌內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）與角叉菜膠（carrageenan，Ca）聯(lián)合造模[7]的大鼠血瘀證模型及機械損傷的大鼠外傷出血模型，考察不同沖服水溫對三七粉散瘀止血作用的影響，以期為三七粉合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量（200 ± 20）g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（皖）2017-001，動物合格證號：1107261911002543。常規(guī)飼養(yǎng)1周，以適應環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20 ～ 25 ℃，濕度40% ～ 60%。

1.1.2 藥物與試劑 三七，120頭，批號：1701166，購自安徽亳藥千草國藥股份有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學彭華勝教授鑒定為五加科植物三七(Burk.) F. H. Chen 的干燥根；三七粉（自制，最細粉，過150目篩）；細菌內(nèi)毒素（LPS，批號：320V035），購自Solarbio公司；角叉菜膠（Ca，批號：ZT18139K），購自合肥博美生物科技有限責任公司；阿司匹林泡騰片（批號：1806211），購自AstraZeneca公司；云南白藥（批號：ZLA1732），購自云南白藥集團股份有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素1β（interleukin-1β，IL-1β），白介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號：201905），均購自酶免；凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activeated partial thromboplasting time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）和凝血酶時間（thrombin time，TT）測定試劑盒（批號：562889、556932A、547583和48723），均購于SIEMENS公司。

1.1.3 儀器 SA-9000全自動血流變儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；CS-5100全自動凝血分析儀（日本SYSMEX株式會社）；5430R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 散瘀作用研究 （1）溶劑配制。LPS用生理鹽水配制成1 g·L-1儲備液，用0.22 μm濾膜除菌后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前稀釋至50 mg·L-1。Ca用生理鹽水配成10 g·L-1，沸水浴1 h使之完全溶解后，冷卻備用。

（2）造模與分組。雄性SD大鼠70只，隨機分為7組，正常組，模型組，陽性對照組（阿司匹林，3.6 mg·kg-1）和不同水浴溫度（30、40、50和100 ℃）處理的三七粉給藥組（PNP組，810 mg·kg-1），每組10只，正常組和模型組灌胃純水，給藥持續(xù)14 d。模型組及各給藥組大鼠于給藥第12 天腹腔注射Ca 25 mg·kg-1，16 h后再靜脈注射LPS 50 μg·kg-1；正常組則在模型組給予Ca和LPS時分別腹腔注射和靜脈注射給予相同體積的生理鹽水。給藥第14 天，各組大鼠處死前禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，分別置于肝素鈉和枸櫞酸鈉抗凝的血液生化管存放。

（3）組織病理學檢查。于給藥第14 天處死，從距尾尖部約2 cm處橫切鼠尾，10%福爾馬林固定。石蠟切片，HE染色，病理學檢查，觀察血管內(nèi)的血栓形成情況。

（4）血液流變學和凝血指標測定。取肝素鈉抗凝血2 mL，1 mL檢測全血黏度，剩余抗凝血離心（3 000 r·min-1，10 min），取血漿，測定血漿黏度。取枸櫞酸鈉抗凝血2 mL，離心（3 000 r·min-1，10 min），取血漿，測定凝血4項指標（PT、APTT、Fib和TT）。

（5）生化指標測定。造模2 h后，大鼠眼眥取血，至非抗凝離心管中，37 ℃水浴，至血塊凝結(jié)，離心（3 000 r·min-1，10 min），取血清，ELISA法測定TNF-α、IL-1β和IL-6。

1.2.2 止血作用研究 （1）分組及給藥。雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，正常組，陽性對照組（云南白藥，YNBY，135 mg·kg-1），不同水浴溫度（30、40、50和100 ℃）處理的三七粉給藥組（810 mg·kg-1），每組10只，正常組灌胃純水，連續(xù)給藥14 d。給藥第14 天，各組大鼠處死前禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，分別置于肝素鈉和枸櫞酸鈉抗凝的血液生化管存放。

（2）出血時間（bleeding time, BT）測定。于末次給藥后30 min，以利剪將大鼠尾尖0.5 cm處橫斷，待血液自然流出后計時，每隔30 s用濾紙吸去血滴1次，直至血液自然停止（濾紙吸時無血斑），秒表記錄并計算出血時間[8-9]。

（3）凝血時間（coagulation time, CT）測定。于末次給藥后1 h，用長10 cm、內(nèi)徑1 mm的毛細玻璃管由大鼠眼瞼插入眥球后靜脈叢，深約4 ～ 5 mm采血，血液注滿后取出毛細管平放于桌上，立即用秒表計時，每隔15 s折斷兩端毛細玻璃管約1.5 cm，并緩慢向左右拉開，直至血凝絲出現(xiàn)為止，所用時間即為凝血時間[10-11]。

（4）血液流變學和凝血指標測定。同“1.2.1（4）”項方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 散瘀作用

HE染色結(jié)果表明（圖1），與正常組相比，模型組的血栓數(shù)量明顯增加。血液流變學結(jié)果（表1）顯示，與正常組比較，模型組大鼠全血黏度在不同切變率下均具極顯著性差異（< 0.01），黏度明顯升高，紅細胞聚集指數(shù)顯著升高（< 0.05），說明造模后大鼠血液呈“黏、聚”狀態(tài)；凝血指標結(jié)果（表2）顯示模型組APTT和TT指標均極顯著性延長 （< 0.01），呈現(xiàn)低凝狀態(tài)，與文獻[12-15]報道的一致，表明模型建立時消耗了大量凝血因子和血小板；FIB含量極顯著性增加（< 0.01），表明大鼠血瘀癥模型造模成功。

各給藥組病理切片結(jié)果相似，均有抗血栓形成效果。與模型組相比，40 ℃處理的三七粉組抑制血栓形成效果顯著。各給藥組不同切變率下的全血黏度、血漿黏度和紅細胞聚集指數(shù)均呈下降趨勢，其中各給藥組的血漿黏度與模型組相比均具顯著性差異（< 0.05）；不同溫度水沖服后的三七粉組與模型組相比，30、40和50 ℃處理組全血黏度均顯著降低（< 0.05）；40 ℃處理組紅細胞聚集指數(shù)顯著降低（< 0.05）。各給藥組凝血4項指標與模型組相比，APTT和TT值均顯著下降（< 0.01），表明三七粉可有效緩解模型大鼠的低凝狀態(tài)；三七粉給藥組均可顯著降低升高的FIB值（< 0.05），表明三七粉具有抗血栓形成的作用。

由圖2可知，模型組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平較正常組升高，各給藥組的炎癥因子水平均呈下降趨勢，但均無顯著性差異。

箭頭指示血栓，基準尺比例，100 μm。

Figure 1 Effects of PNP on thrombosis

2.2 止血作用

三七粉對大鼠出血時間（BT）和凝血時間（CT）結(jié)果（表3）表明，與正常組相比，各三七粉給藥組BT均顯著延長，各組凝血時間均無顯著性差異。血液流變學結(jié)果（表4）顯示，給藥組與正常組相比，全血黏度和紅細胞聚集指數(shù)均無顯著性差異，30和40 ℃處理的三七粉組血漿黏度顯著降低（< 0.05）；凝血4項指標（表5）中，各給藥組PT、APTT和Fib均存在下降趨勢，其中40和50 ℃處理組中APTT值顯著降低。結(jié)果提示三七粉內(nèi)服對外傷出血無止血效果。

表1 三七粉對血瘀證大鼠血液流變學指標和紅細胞類指標的影響（, n = 10）

注：PNP為三七粉給藥組，< 0.05，< 0.01，均與正常組比較。< 0.05，< 0.01，均與模型組比較。下同。

表 2 三七粉對血瘀證大鼠凝血指標的影響（, n = 10）

#P < 0.05，與模型組比較。(a) TNF-α; (b) IL-1β; (c) IL-6.

Figure 2 Effects ofpowder on the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in rats with blood stasis(mean ± SD,= 10)

表3 三七粉對大鼠出血時間和凝血時間的影響（, n = 10）

注：< 0.05，< 0.01，均與正常組比較。下同。

表4 三七粉對大鼠血液流變學指標和紅細胞類指標的影響（, n = 10）

表5 三七粉對大鼠凝血指標的影響

3 討論與結(jié)論

我國關(guān)于血瘀證較為系統(tǒng)的認識最早出自《內(nèi)經(jīng)》，其中關(guān)于血瘀的證和因闡述如下：1）損傷瘀血，《素問·刺腰痛篇》：“得之，重傷腰，……惡血歸之”；2）寒凝瘀血，《素問·八正神明論》：“天寒日陰，則人血凝泣”；3）大怒瘀血，《素問·生氣通天論》：“大怒則形氣絕，而血菀於上，使人薄厥”；4）病久入深瘀血，《素問·痹論》：“病久入深，營衛(wèi)之行澀，經(jīng)絡時疏、故不通”；5）瘀血五臟卒痛，《素問·舉痛論》：“寒氣客于腸胃之間，膜原之下，血不得散、小絡急引，故痛”。從中醫(yī)角度來看，血瘀證的形成跟神經(jīng)精神、環(huán)境、體質(zhì)和外傷等因素有著密切關(guān)系。目前血瘀證動物模型的建立可通過物理刺激如電針刺激、定量化重力擊傷器等，也可采用化學物質(zhì)刺激如腹腔注射高分子右旋糖酐、腹腔注射腎上腺素等，此外還有研究者采用化學刺激與物理刺激結(jié)合的方法如注射腎上腺素的同時加以冰水浸泡來建立血瘀證模型[16-20]。

通過文獻調(diào)研及預試驗，發(fā)現(xiàn)通過物理刺激或注射腎上腺素建立的血瘀模型存在重復性差、形成的血瘀持續(xù)時間短等缺陷，故本研究最終采用以細菌內(nèi)毒素（LPS）與角叉菜膠（Ca）兩種因素聯(lián)合造模。LPS可誘導單核巨噬細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞分泌大量炎性因子（TNF-α、IL-6和IL-1等），出現(xiàn)炎癥反應[12]。Ca可致大鼠炎癥模型，誘使大鼠全身發(fā)熱以及體內(nèi)IL-1β水平顯著升高[21-23]。LPS與Ca聯(lián)用可誘導單核巨噬細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞分泌大量炎性因子，激活外源性凝血系統(tǒng)，形成血栓[24-29]。文獻報道LPS與Ca聯(lián)合造模后產(chǎn)生的TNF-α和IL-6在血液中持續(xù)時間較短，造模8 h即恢復正常，2 h為TNF-α和IL-6產(chǎn)生的高峰時間，故將取樣時間定為造模后2 h[7]。

散瘀試驗結(jié)果表明：30、40和50 ℃處理的三七粉可顯著降低血瘀證大鼠血液的“黏”態(tài)，40 ℃處理組對血液“聚”態(tài)的影響最為顯著；且三七粉各組均能有效緩解血瘀大鼠的低凝狀態(tài)對抗血栓的形成。表明三七粉內(nèi)服散瘀作用顯著，其中以40 ℃水沖服處理最佳。此外三七對于炎性因子的影響目前已有相關(guān)報道[30-31]，但本試驗結(jié)果顯示無論是模型組還是給藥組炎癥因子水平均無顯著性差異，這一差異可能是由于造模方法不同所引起，但整體趨勢與文獻報道基本一致。止血作用研究結(jié)果顯示，各給藥組與對照組相比凝血時間無顯著性差異，出血時間顯著延長，血漿黏度降低，出現(xiàn)抑制凝血功能的趨勢。該結(jié)果表明三七粉內(nèi)服對大鼠外傷基本無止血作用，提示三七粉治療外傷出血不宜內(nèi)服。

綜上，三七粉可改變SD大鼠血液流變學行為，抑制血栓形成。沖服水溫差異對三七粉的散瘀作用有顯著影響，40 ℃溫水沖服效果最佳。

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Effects of temperature on blood stasis and hemostasis of

SUN Xueqin1, LIANG Xiao2, GUI Shuangying2

(1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031;2. Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012)

powder (PNP) has a clear effect of arresting bleeding by resolving blood stasis, which is often taken by water suspension in clinic. To study the influence of water suspension temperature on PNP effect of arresting bleeding by resolving blood stasis, so as to provide some references for patients taking PNP, lipopolysaccharide (LPS) and carrageenan (Ca) were used to set up blood stasis model, and mechanical damage was used to establish a trauma-hemorrhage model. The effects of water suspension treatment at different temperatures (30, 40, 50 and 100 ℃) on dissipate stasis and stanch bleeding of PNP were evaluated using the whole blood/plasma viscosity, erythrocyte aggregation indexes, four indicators of blood coagulation (PT, APTT, Fib and TT), levels of TNF-α, IL-1β and IL-6, hemostatic properties such as bleeding time (BT) and coagulation time (CT). The results showed that PNP can change hemorheological behavior, reduce blood viscosity and inhibit thrombosis in SD rats. The water bath temperature has a significant influence on the dissolving stasis of PNP, and at a range of temperatures (30 - 40 ℃), it can significantly reduce the whole blood viscosity of rats with blood stasis syndrome and the plasma viscosity of normal rats, and improve the rheological properties of blood.

;hydrothermal temperature; disperse blood stasis; haemostasis

R285; S865.12

A

1672-352X (2021)05-0790-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211025.001

2021-10-26 8:51:28

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211025.1324.002.html

2021-04-01

安徽省重大專項（18030801128）資助。

孫學勤，碩士研究生。E-mail：Sunxmxq0615@163.com

通信作者:桂雙英，教授，博士生導師。E-mail：guishy0520@126.com