QuEChERS-HPLC法快速測定黃豆芽中6-芐基腺嘌呤含量的不確定度評定

劉飛波 - 王 希 劉水平 -

(株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412000)

6-芐基腺嘌呤是一種人工合成的生物生長調(diào)節(jié)劑，通過刺激細胞分裂引起植物生長和發(fā)育，抑制呼吸激酶而延長綠色蔬菜的保鮮，但長期過量食用會出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象[1-3]。2015年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計劃生育委員根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》等相關(guān)法律的規(guī)定，禁止豆芽生產(chǎn)過程中使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)[4]。

目前，GB/T 23381—2009規(guī)定的6-芐基腺嘌呤檢測方法提取凈化耗時較長，需要過SPE小柱處理，經(jīng)濟成本比較高。而QuEChERS法是一類快速、簡便、經(jīng)濟、高效、耐用和安全的樣品前處理方法，目前常用于植物源性產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留以及動物源性食品的檢測。曾志杰等[5]公開發(fā)表了非標準方法液質(zhì)方法測定豆芽中6-芐基腺嘌呤含量的合成不確定度，其前處理較為復(fù)雜，需要經(jīng)過MCX固相小柱處理，成本較高。研究嘗試結(jié)合QuEChERS前處理方法，采用高效液相色譜法檢測果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中6-芐基腺嘌呤含量，根據(jù)CNAS-GL 06—2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的要求，參考相關(guān)文獻[5-11]，通過分析各不確定度分量的來源，建立評定6-芐基腺嘌呤含量數(shù)學(xué)模型，計算分析過程，進行不確定度評定，利用不確定度評定對QuEChERS前處理果蔬類農(nóng)產(chǎn)品的檢測方法進行評價分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀：Thermo U3000型，美國賽默飛世爾科技公司；

電子天平：MS205DU型，瑞士梅特勒—托利多國際貿(mào)易有限公司。

6-芐基腺嘌呤：98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

提取鹽包、凈化包：中國上海安譜實驗科技股份有限公司；

甲醇：色譜純，美國Honeywell公司；

甲酸：優(yōu)級純，上海國藥集團化學(xué)試劑公司。

1.2 樣品

果蔬類樣品：黃豆芽4批，綠豆芽2批，草莓2批，黃瓜2批，市售。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 稱取10.0 g均質(zhì)試樣于50 mL具塞離心管中，加入25.0 mL含體積分數(shù)1%甲酸的甲醇溶液，再加入提取鹽包(內(nèi)含4.0 g無水MgSO4、1.0 g無水醋酸鈉)，高速均質(zhì)1 min，8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液于離心管中，加入凈化包(內(nèi)含有150 mg PSA及850 mg無水MgSO4，100 mg C18固相萃取吸附劑)，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，精確移取5.0 mL溶液至具塞離心管中，弱N2氣流吹干，用甲醇定容至1.0 mL，甲醇定容后的溶液經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，作為待測液供HPLC分析[7]。

1.3.2 色譜條件 色譜條件的選擇參照GB/T 23381—2009以及相關(guān)文獻資料[7]，色譜柱：Welch Xtimate C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇—0.02 mol/L乙酸銨混合液(V甲醇∶V乙酸銨=1∶1)，等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測波長267 nm。

1.3.3 標準溶液的制備 標準溶液的配制參照GB/T 23381—2009 的要求，經(jīng)高效液相色譜檢測后，采用外標法定量。

(1) 標準儲備液：精密稱取6-芐基腺嘌呤對照品0.011 83 g置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度即得標準儲備液1.165 mg/mL，于-18 ℃下保存。

(2) 標準工作液：用甲醇稀釋上述標準儲備液，配成5個不同質(zhì)量濃度的系列標準工作液，分別為0.058 26，0.116 5，0.291 5，0.582 6，1.165 0 μg/mL，采用外標法進行定量。

1.3.4 6-芐基腺嘌呤含量計算

(1)

式中：

X——樣品中6-芐基腺嘌呤含量，mg/kg；

C——測試溶液中的質(zhì)量濃度，μg/mL；

C0——空白溶液中的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

m——樣品取樣量，g；

f——稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

結(jié)合QuEChERS前處理方法，按“1.3.2項”色譜條件上機分析，6-芐基腺嘌呤與各雜質(zhì)峰及溶劑峰能很好地分離，見圖1。經(jīng)過檢測分析，1批黃豆芽有檢出6-芐基腺嘌呤。以黃豆芽為主要分析對象，評價新的前處理方法對果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中6-芐基腺嘌呤含量測定的不確定度的影響。

2.1 不確定度來源分析

圖1 6-芐基腺嘌呤樣品和標樣的HPLC分離效果圖Figure 1 Separation of sample and 6-benzyladeninestandards by HPLC

2.2 不確定度量化分析

根據(jù)樣品測定過程及數(shù)學(xué)模型，影響試驗不確定度的主要分量見圖2。

圖2 不確定度影響因素構(gòu)成圖Figue 2 Constitution of uncertainty of influential factor

2.2.1 標準溶液配制過程中引入的相對標準不確定度

配制5個梯度的6-芐基腺嘌呤標準溶液(11.65 μg/mL→0.058 26 mg/mL)中使用1 mL的移液槍5次，10 mL A級容量瓶3次，100 mL A級容量瓶2次。引入的相對不確定度為：

綜上，6-芐基腺嘌呤標準溶液配制過程中引入的相對標準不確定度合成為：

2.2.4 標準曲線引入的相對標準不確定度 6-芐基腺嘌呤和儀器響應(yīng)峰面積見表2。試驗將質(zhì)量濃度為0.058 26，0.116 5，0.291 3，0.582 6，1.165 μg/mL的標準溶液分別進樣3次，結(jié)果見表2。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合工作曲線方程為A=bC+d=0.792 7C-0.011 9(R2=0.998 2)。

表1 移液器引入的不確定度

表2 標準曲線擬合數(shù)據(jù)

稱取10.24 g粉碎好的果蔬類(黃豆芽)樣品，對同一樣品進行5次測量，由校準曲線求得6-芐基腺嘌呤濃度為0.686 5 μg/mL，含量為0.335 mg/kg。校正曲線引入的相對標準不確定度urel(curve)的計算公式為：

urel(curve)=u(curve)/c，

(2)

(3)

(4)

式中：

b——斜率，0.797 2；

p——測試次數(shù)，5；

n——校準次數(shù)，15；

c——樣品黃豆芽中的質(zhì)量濃度，0.686 5 μg/mL；

Ai——第i個校準標準溶液的測定峰面積，mAu·min；

ci——第i個校準標準溶液的濃度，μg/mL；

d——標曲截距，-0.011 9。

SR——標準溶液峰面積殘差的標準差，0.008 33。

將以上數(shù)據(jù)代入式(2)求得urel(curve)=0.028 2。

表3 回收率引入的不確定度

重復(fù)測定陽性樣品(黃豆芽)，平行測定6份，所得的峰面積按標曲換算成質(zhì)量濃度，分別為0.335，0.331，0.339，0.336，0.333，0.326 mg/kg，平均質(zhì)量濃度為0.334 mg/kg；測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度為：

2.2.6 樣品前處理定容引入的相對標準不確定度

2.3 合成不確定度

綜上分析，HPLC法測定果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中的6-芐基腺嘌呤的相對標準不確定度的分量見表4。

將合成相對標準不確定度為：

表4 相對標準不確定度分量表

取k=2，P=95%，則擴展相對標準不確定度U=k×uc=0.026 mg/kg，則果蔬類農(nóng)產(chǎn)品(黃豆芽)中的6-芐基腺嘌呤含量可以表示為：(0.335±0.026) mg/kg，k=2(95%的置信區(qū)間)。即：6-芐基腺嘌呤的含量測定結(jié)果出現(xiàn)在(0.335±0.026) mg/kg區(qū)間的概率為95%。

由表4可見，文中不確定度的主要來源是標準曲線的擬合[urel(curve)=0.028 2]、梯度標準溶液配制[urel(c)=0.018 2]以及測定的回收率[urel(r)=0.015 1]。曾志杰等[5]有關(guān)液質(zhì)方法測定豆芽中6-芐基腺嘌呤含量的合成相對標準不確定度uc=0.033 4，略低于文中的合成相對標準不確定度0.038 3，但其未考慮整個前處理定容所引入的不確定度，分析不夠全面。唐韻熙[6]有關(guān)液質(zhì)方法對豆芽中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤殘留量的不確定度評定，其合成相對標準不確定度urel=0.093 98，遠高于文中的不確定度評定的數(shù)據(jù)，即使不考慮檢測儀器引入的相對標準不確定度urel(fm)=0.04，其合成相對標準不確定度urel(x)=0.079 6，也高于文中的。唐韻熙[6]的研究中不確定度的主要來源分別是樣品的前處理[urel(樣品)=0.057 74]、擬合標準曲線[urel(curve)=0.040 113]、檢測儀器[urel(A)=0.04]以及梯度標準溶液配制[urel(c)=0.030 16]。通過比較兩者之間的不確定度的主要來源，作者發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的前處理方式，引入了大量的不確定度。新的前處理方法簡化了前處理步驟，減少了溶劑的消耗，有利于環(huán)境保護和檢驗人員的身體健康。

3 結(jié)論

對果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中6-芐基腺嘌呤進行檢測時，采用QuEChERS法進行前處理，能夠提升前處理速度，減少溶劑的消耗，減少污染，保護人員身體健康。樣品的稱取、提取、凈化以及定容等過程都會引入不確定度，但其主要來源于擬合標準工作曲線求得樣品濃度過程以及標準溶液的配制，而其他因素影響較小。因此，平時檢驗檢測過程中要注意前處理的規(guī)范性，盡可能選用高精度的A級量具以及精確配制標準溶液等。同時應(yīng)定期對高效液相色譜儀進行保養(yǎng)、期間核查以及檢定校準，以保持儀器狀態(tài)良好，降低儀器本身帶來的不確定度的影響，保證測定結(jié)果的可靠性。