一測(cè)多評(píng)法測(cè)定壯藥三加皮中5個(gè)酚酸類(lèi)成分的含量*

郭勇秀，蔣 林,2**，農(nóng)毅清，李芳嬋，隨家寧，魏博偉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥工程技術(shù)中心，廣西南寧 530001；3.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧 530001)

0 引言

三加皮是五加科植物白簕(Acanthopanaxtrifo-liatus(L.) Merr.)的干燥根，又名蹦樂(lè)、刺三甲、刺三加、白簕、鵝掌簕、苦刺、三葉五加等。在《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》《廣西植物名錄》《廣西中藥資源名錄》中均有記載，被收錄在《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第一卷)》，是廣西特色的民間常用藥用植物，其根皮可入藥，其嫩葉常作為蔬菜食用。三加皮味苦，辛，凉，主要含有酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖、皂苷等成分。藥理作用主要有祛風(fēng)利濕、舒筋活血、清熱解毒[1]，抗炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等[2-6]。

三加皮的食用部分一直備受關(guān)注，近年來(lái)學(xué)者們對(duì)其食用部位研究出多種保健品，有檸檬簕菜茶、陳皮簕菜茶、燕麥簕菜茶、皇竹草和簕菜減茶、簕菜泡騰固體飲料、簕菜保健餅干、簕菜保健顆粒、簕菜保健硬糖等[7-14]，但對(duì)藥用根部研究甚少，有學(xué)者對(duì)其根部總黃酮進(jìn)行研究[15]，對(duì)根部酚酸類(lèi)成分研究報(bào)道較少，未見(jiàn)建立根部相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，難以對(duì)三加皮的質(zhì)量進(jìn)行控制，給臨床用藥及資源利用帶來(lái)較大的困難?？梢?jiàn)對(duì)三加皮根部進(jìn)行研究，為后續(xù)建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究基礎(chǔ)及臨床用藥參考是很有必要的，也為開(kāi)發(fā)利用三加皮藥用資源提供參考依據(jù)。

前期課題組對(duì)其質(zhì)量標(biāo)志物的分析發(fā)現(xiàn)，三加皮中所含的豐富的酚酸類(lèi)成分是其主要活性成分之一，初步推斷三加皮中含有新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等成分，此類(lèi)成分都屬于咖啡?？鼘幩岬姆铀犷?lèi)成分。據(jù)研究，該類(lèi)成分有多種藥理活性，如有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[16]。在研究中，單一成分難以全面反映三加皮的質(zhì)量，因此需選擇多成分進(jìn)行質(zhì)量控制分析。但采用多成分對(duì)質(zhì)量控制時(shí)，部分對(duì)照品稀缺及使用量大、價(jià)格昂貴，導(dǎo)致測(cè)定成本增加，而一測(cè)多評(píng)法可以一種價(jià)廉、穩(wěn)定易得的指標(biāo)成分為內(nèi)參物，通過(guò)相對(duì)校正因子測(cè)定其他成分含量，同時(shí)測(cè)定多種成分并降低實(shí)驗(yàn)成本。目前尚未有相關(guān)研究建立新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的一測(cè)多評(píng)方法。因此，本研究擬建立測(cè)定多種活性成分含量的一測(cè)多評(píng)法，比較一測(cè)多評(píng)法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)測(cè)定的結(jié)果，考察QAMS的準(zhǔn)確性與科學(xué)性，為合理評(píng)價(jià)壯藥三加皮藥材的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究三加皮酚酸類(lèi)成分、推廣三加皮的藥用價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters e2695 UV高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó) Waters 公司),Agilent 1260 高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó) Agilent 科技有限公司),Shimadzu LC-2030 Plus 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；色譜柱：phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μL)及Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μL)，Mettler Toledo XS105DU電子分析天平，KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，密理博超純水機(jī)(廣西南寧市博美生物科技有限公司)。

對(duì)照品綠原酸(批號(hào)110753-201817，純度≥96.8%)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸(批號(hào)DST190124-015，純度≥98%)，異綠原酸B(批號(hào)DST190226-037，純度≥99.04%)，異綠原酸A(DST190113-036，純度≥99.5%)，異綠原酸C(DST190110-038，純度≥99.47%)，均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，其余為分析純，水為超純水。

10批三加皮藥材信息見(jiàn)表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟高級(jí)鑒定師鑒定，均為五加科植物三加皮Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.的干燥根。

表1 壯藥三加皮樣品信息Table 1 Sample information of Zhuang medicine Acanthopanax trifoliatus(L.)Merr.

1.2 方法

1.2.1 HPLC法色譜條件

色譜柱：phenomenex C18(4.6 nm×250 nm×5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(C)-0.2%磷酸溶液(A)，梯度洗脫(0-6 min，9.5% C；6-15 min，13% C；15-18 min,14% C；18-20 min，15% C；20-30 min，18% C；30-45 min，30% C；45-50 min，35% C)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。以上述色譜條件下三加皮樣品及混合對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖1。

1.新綠原酸；2.綠原酸；3.異綠原酸B；4.異綠原酸A；5.異綠原酸C1.neochlorogenic acid；2.chlorogenic acid；3.isochlorogenic acid B；4.isochlorogenic acid A；5.isochlorogenic acid C圖1 混合對(duì)照品(a)和三加皮樣品(b)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference (a) and Acanthopanax trifoliate sample (b)

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品適量，加50%甲醇溶解，分別制成濃度為1.03,1.55,1.16,1.01,1.21 mg/mL的對(duì)照品溶液；另取上述溶液適量，置于同一量瓶中，加50%甲醇稀釋?zhuān)瞥珊戮G原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的濃度分別為0.019,0.390,0.200,0.033,0.060 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取三加皮粉末約0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇30 mL，稱(chēng)重，超聲30 min，冷卻，補(bǔ)重，加50%乙醇補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液15 mL，揮干，用50%乙醇定容至5 mL，搖勻，離心，取上清液，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC定量方法的建立

2.1.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取1.2.2節(jié)的混合對(duì)照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄5個(gè)成分的峰面積值，以峰面積(y)對(duì)應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量x(μg)進(jìn)行回歸分析。得各回歸方程及線(xiàn)性范圍(表2)。

表2 5種酚酸類(lèi)成分線(xiàn)性回歸方程Table 2 Linear regression equations of 5 phenolic acids

2.1.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按1.2.1節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積的精密度RSD值分別為0.05%、0.07%、0.39%、0.06%、0.75%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批三加皮供試品粉末，精密稱(chēng)定，按照1.2.3節(jié)的方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取5 μL進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個(gè)成分平均含量及其RSD值，結(jié)果得到新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個(gè)成分平均含量分別為1.038，16.320，1.840，17.360，5.519 mg/g，RSD值分別為1.1%、2.4%、2.1%、2.4%、2.4%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份三加皮供試品溶液5 μL，分別于制備后0，2，4，6，8，12 h進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個(gè)成分峰面積值，計(jì)算RSD值，結(jié)果分別為0.90%、0.22%、1.20%、0.39%、1.30%，表明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量三加皮樣品粉末，精密稱(chēng)定6份，每份約0.25 g，分別精密加入一定量的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品，按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，分別測(cè)定其峰面積，計(jì)算回收率。新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均回收率分別為100%、105%、98%、103%、104%；RSD值分別為2.31%、2.24%、1.90%、1.07%、1.43%，表明該方法的準(zhǔn)確度很高。

2.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算

分別精密吸取1.2.2節(jié)的混合對(duì)照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL測(cè)定，以綠原酸為內(nèi)參物(S)，按照公式(1)計(jì)算新綠原酸(a)、異綠原酸B (b)、異綠原酸A (c)、異綠原酸C (d)的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 壯藥三加皮一測(cè)多評(píng)法測(cè)定5個(gè)酚酸類(lèi)成分的相對(duì)校正因子fi/STable 3 Relative correction factors fi/S for the determination of 5 phenolic acids components in Zhuang medicine Acanthopanax trifoliatus(L.)Merr.by QAMS method

(1)

其中，Ai、AS分別為待測(cè)成分及內(nèi)參物的峰面積，Wi、WS分別為待測(cè)成分及內(nèi)參物的量。

2.3 相對(duì)校正因子(fi/S)的耐用性考察

2.3.1 不同高效液相色譜系統(tǒng)及色譜柱對(duì)fi/S的影響

精密吸取1.2.2節(jié)的混合對(duì)照品溶液5 μL測(cè)定，分別考察Waters e2695 UV、Agilent 1260及Shimadzu LC-2030 Plus 3種色譜儀和phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μL)及Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μL) 2種色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，并計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于3%(表4)，表明該法重現(xiàn)性良好。

表4 不同色譜儀器和色譜柱下測(cè)得的相對(duì)校正因子fi/S (n=3)Table 4 Relative correction factors fi/S(n=3) measured under different chromatographic instruments and columns (n=3)

2.3.2 不同色譜柱柱溫對(duì)fi/S的影響

考察不同柱溫(25，30，35℃)對(duì)各fi/S的影響。新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的RSD值依次為0.76%、0.79%、0.08%、0.80%(表5)，表明柱溫波動(dòng)對(duì)各相對(duì)效正因子fi/S無(wú)顯著影響。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子fi/S的影響Table 5 Effects of different column temperatures on relative correction factors fi/S

考察不同流速(0.6，0.8，1.0 mL/min)對(duì)各fi/S的影響。新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的RSD值依次為0.76%、0.79%、0.08%、0.80%(表6)，表明不同流速對(duì)各相對(duì)校正因子fi/S無(wú)顯著影響。

表6 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子fi/S的影響Table 6 Effects of volume flow rate on relative correction factors fi/S

2.4 待測(cè)成分色譜峰的定位

本研究考察了對(duì)不同色譜柱中各待測(cè)色譜峰與參照物峰的保留時(shí)間差(⊿ti/S)及相對(duì)保留時(shí)間(ti/S)進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)⊿ti/S及ti/SRSD值均小于5%，⊿ti/S波動(dòng)較小(表7，8)，因此，采用⊿ti/S對(duì)待測(cè)組分色譜峰進(jìn)行定位。

表7 不同色譜柱下待測(cè)成分的色譜峰定位(⊿ti/S法,n=3)Table 7 Chromatographic peak location for the components to be tested under different chromatographic columns (⊿ti/S method,n=3)

2.5 QAMS與ESM測(cè)定結(jié)果的比較

取10批產(chǎn)地的三加皮樣品，按照1.2.3節(jié)方法制備樣品溶液，按照1.2.1節(jié)的色譜條件測(cè)定，記錄待測(cè)組分峰面積，分別用ESM法與QAMS法計(jì)算其含量并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，其相對(duì)誤差RE均小于3%(表9)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，結(jié)果表明，P=0.000 0<0.05，2種方法所得值無(wú)顯著性差異，由此說(shuō)明QAMS法用于三加皮藥材的多種酚酸類(lèi)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是可行的。

表8 不同色譜柱下待測(cè)成分的色譜峰定位(ti/S法,n=3)Table 8 Chromatographic peak location for the components to be tested under different chromatographic columns (ti/S method,n=3)

表9 QAMS法與ESM法測(cè)得10批三加皮中5種酚酸的含量(n=3) Table 9 Content of 5 phenolic acids in ten batches of Acanthopanax trifoliatus(L.)Merr.by QAMS and ESM (n=3)

3 討論

目前有文獻(xiàn)報(bào)道三加皮根部總黃酮提取工藝[15]，但對(duì)三加皮質(zhì)量控制研究甚少，因此，本研究采用HPLC法，建立一測(cè)多評(píng)法(QAMS)對(duì)三加皮中酚酸類(lèi)成分含量進(jìn)行測(cè)定。

本研究考察了不同柱溫、流速、色譜柱、儀器對(duì)所建立的校正因子的影響，結(jié)果表明各成分的校正因子重現(xiàn)性良好。QAMS旨在通過(guò)某一參照物峰實(shí)現(xiàn)對(duì)其他待測(cè)色譜峰的準(zhǔn)確定位，常規(guī)方法通過(guò)保留時(shí)間差(⊿ti/S)或相對(duì)保留時(shí)間(ti/S)定位，通過(guò)保留時(shí)間差或相對(duì)保留值等參數(shù)不能準(zhǔn)確定位時(shí)，選用定性用的對(duì)照品對(duì)待測(cè)組分色譜峰進(jìn)行定位[17]。本研究應(yīng)用保留時(shí)間差(⊿ti/S)或相對(duì)保留時(shí)間(ti/S)對(duì)各成分的色譜峰進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)⊿ti/S及ti/S在不同儀器和色譜柱中重現(xiàn)性較好，同時(shí)結(jié)合色譜峰峰型，可準(zhǔn)確對(duì)目標(biāo)峰的位置做出判斷。研究測(cè)定了10批三加皮中的5個(gè)成分，結(jié)果顯示QAMS與ESM的統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明選擇綠原酸為內(nèi)參物，可建立QAMS法用于三加皮藥材質(zhì)量控制。

如何有效建立穩(wěn)定有效的對(duì)中藥可控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直是熱門(mén)探討話(huà)題，中藥多成分的復(fù)雜性決定了單一成分或指標(biāo)測(cè)定難以評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，由此提出多成分質(zhì)量控制的模式，并可直接對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。本研究通過(guò)一測(cè)多評(píng)法對(duì)多指標(biāo)成分的測(cè)定反應(yīng)三加皮的質(zhì)量，酚酸類(lèi)成分是三加皮主要活性成分之一，但新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品昂貴，而綠原酸對(duì)照品價(jià)廉易得，化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，在10批三加皮藥材中含量較高，是三加皮的主要活性成分之一，所以選擇綠原酸為內(nèi)參物進(jìn)行QAMS分析。通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定綠原酸，用相對(duì)校正因子來(lái)計(jì)算新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 4種成分的含量，與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果相比較，結(jié)果無(wú)顯著差異，檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 5種成分的含量，符合多成分測(cè)定，不僅可全面控制三加皮的質(zhì)量，解決對(duì)照品價(jià)格昂貴難獲得的問(wèn)題，降低檢測(cè)成本，還可為三加皮質(zhì)量控制提供多成分指標(biāo)評(píng)價(jià)模式，對(duì)進(jìn)一步利用三加皮資源及研究其保健作用和藥用價(jià)值提供科學(xué)參考，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

此外，課題組采用高效液相色譜與Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，考察不同產(chǎn)地的三加皮成分，借助賽默飛中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)OTCML分析，但在HPLC法測(cè)定其含量時(shí)，三加皮樣品中有的色譜峰跟實(shí)驗(yàn)室的對(duì)照品沒(méi)有對(duì)應(yīng)上，在有關(guān)三加皮的研究文獻(xiàn)上也沒(méi)有指認(rèn)出。本課題組今后會(huì)進(jìn)一步對(duì)三加皮活性成分及藥理藥效進(jìn)行深入的研究，為三加皮的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供科學(xué)依據(jù)。