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    鐵皮石斛多糖對糖尿病大鼠脂代謝異常的改善作用及機制

    2021-12-03 07:27:46寇戰(zhàn)利陳社論劉冰林張效科李聰郭杰
    關(guān)鍵詞:鐵皮石斛多糖

    寇戰(zhàn)利, 陳社論, 劉冰林, 張效科, 李聰, 郭杰

    (1.咸陽市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科,陜西咸陽 712000;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,陜西咸陽 712083)

    隨著人們生活方式和飲食方式的改變,2型糖尿病的患病率不斷上升。臨床已成功研制出許多口服降糖藥,如磺酰脲類、噻唑烷二酮類等。雖然這些藥物降糖療效顯著,但存在低血糖、過敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)、肝損傷、血液系統(tǒng)不良反應(yīng)等副作用[1]。目前,尋找療效好、毒性低的天然抗糖尿病活性成分成為研究的熱點。糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”的范疇,基本病機以陰虛為本,燥熱為標(biāo)[2]。鐵皮石斛是治療“消渴”的常用中藥,具有生津益胃、滋陰清熱的功效[3]。鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛中發(fā)揮藥理作用的主要活性成分[4],具有抗疲勞、抗氧化、抗癌、降血糖血脂、免疫調(diào)節(jié)及肝保護等作用[5-7]。有研究[8-9]表明,鐵皮石斛多糖可改善糖尿病小鼠血脂代謝紊亂,修復(fù)胰島細(xì)胞,促進胰島素分泌和肝糖原合成,減輕腎損傷。然而,鐵皮石斛多糖降糖降脂作用的潛在機制尚不清楚?;诖?,本研究建立糖尿病大鼠模型,觀察鐵皮石斛多糖對脂代謝異常的改善作用,并探討其可能的作用機制,以期為臨床應(yīng)用鐵皮石斛多糖治療糖尿病提供新的依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 90 只雄性SPF 級6 周齡SD 大鼠,體質(zhì)量180~200 g,由上海南方模式生物科技股份有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2019-0002。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,保持溫度23~25 ℃,濕度60%~65%,晝夜12 h交替環(huán)境中,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

    1.2 藥物、試劑與儀器 鐵皮石斛多糖(北京索萊寶科技有限公司,純度≥85%,批號:180316);鹽酸二甲雙胍腸溶片(河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠,國藥準(zhǔn)字H20083575)。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美國Sigma 公司);檸檬酸(天津永大化學(xué)試劑有限公司);兔抗大鼠胰島素受體底物2(IRS2)、磷酸化IRS2(p-IRS2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)單克隆抗體和蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司);甘油三酯(TG)、空腹胰島素(FINS)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒,總膽固醇(TC)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);超氧化物歧化酶(SOD)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(上海晶抗生物公司);高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(武漢博士康生物工程有限公司)。Multiskan FC全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

    1.3 建模與分組 隨機選取75只大鼠建立糖尿病大鼠模型,剩余15 只為正常組。造模方法參照文獻[10]:建模大鼠用高糖高脂飼料(質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比:10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料)喂養(yǎng),正常組大鼠用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)1個月后,禁食不禁水12 h,建模大鼠給予腹腔注射10 g/L STZ溶液(由0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液冰浴配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)30 mg/kg,正常組腹腔注射等體積的0.1 mmol/L 檸檬酸緩沖液。注射后3 h 禁食,給予大鼠30 g/L 葡萄糖溶液預(yù)防低血糖。3 d 后,所有大鼠禁食12 h,尾靜脈采血測空腹血糖(FBG),若FBG ≥16.7 mmol/L,且維持1 周以上,則判斷造模成功[11]。將造模成功的68 只大鼠隨機分為模型組,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組,每組17只。

    1.4 干預(yù)方法 造模成功24 h后,依照藥理實驗中動物與人體間的等效劑量換算,參照蘆春斌等[12]的大鼠給藥劑量,鐵皮石斛多糖低、高劑量組分別灌胃鐵皮石斛多糖100、200 mg/kg,二甲雙胍組灌胃鹽酸二甲雙胍150 mg/kg,正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。每日1次,共干預(yù)30 d。

    1.5 觀察指標(biāo)與方法

    1.5.1 血FBG、FINS檢測 尾靜脈取血,應(yīng)用血糖儀測定各組大鼠藥物干預(yù)0、15、30 d FBG 水平。于藥物干預(yù)30 d,按照FINS ELISA 試劑盒說明書加樣,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度(OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算FINS的濃度。

    1.5.2 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平檢測 末次藥物干預(yù)結(jié)束后,各組隨機選取7只大鼠,斷頭取血,以3 500 r/min,離心半徑8 cm,離心10 min,得到上清液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩H〕?20 ℃保存?zhèn)溆玫纳锨逡?,分別按照TG、TC、LDL-C、HDL-C試劑盒說明書,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 在500 nm、510 nm、546 nm、546 nm 波長處的OD 值。各生化指標(biāo)水平=(樣本OD 值-空白孔OD 值)/(校準(zhǔn)品OD 值-空白孔OD值)×校準(zhǔn)品濃度。

    1.5.3 血清SOD、MDA水平檢測 取保存在-20 ℃的上清液,按照SOD 試劑盒說明書加樣,采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD 水平,應(yīng)用酶標(biāo)儀測出550 nm 波長處的OD 值。SOD 樣品比活力(U/mL)=(對照管OD值-測定管OD值)/對照管OD值÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

    取保存在-20 ℃的上清液,按照MDA 試劑盒說明書加樣,采用硫代巴比妥酸法測定MDA 水平(μmol/L),應(yīng)用酶標(biāo)儀測出532 nm 處的OD 值。MDA含量(nmol·mL-1)=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol·mL-1)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

    1. 5. 4 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察肝臟組織病理學(xué)變化 將剩余大鼠全部處死,快速從腹腔分離出肝臟組織,用生理鹽水清洗后,左側(cè)肝臟組織用40 g/L 多聚甲醛溶液固定24 h,于4 ℃冰箱保存。右側(cè)肝臟組織置于-80 ℃冰箱中保存。將肝臟組織從固定液中取出,梯度乙醇脫水,二甲苯處理,石蠟包埋,切片(4 μm),HE染色,脫水透明,中性樹脂膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

    1. 5. 5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測肝臟組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 蛋白相對表達(dá)水平 取-80 ℃保存的肝臟組織100 mg,研磨,加入蛋白提取液冰上裂解,離心,取上清,二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量;加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液,100 ℃水浴使蛋白變性,進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE),轉(zhuǎn)膜;50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h;洗膜后分別加入1∶1 000 稀釋的IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、mTOR單克隆一抗和AKT、p-AKT多克隆一抗,4 ℃孵育過夜;洗膜后加入1∶4 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h;洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯影。采用ImageJ軟件分析圖像,以β-actin為內(nèi)參,IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)量用目的蛋白條帶灰度值與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示。

    1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2. 1 各組大鼠血FBG、FINS 水平比較 FBG、FINS 水平組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組干預(yù)0、15、30 d FBG水平和FINS 水平均升高(P<0.05);與模型組比較,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組干預(yù)0 d FBG 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),干預(yù)15、30 d FBG 水平和FINS 水平均降低(P<0.05);鐵皮石斛多糖高劑量組干預(yù)15、30 d FBG水平和FINS 水平與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著干預(yù)時間0、15、30 d 增加,模型組FBG 水平持續(xù)上升,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組FBG 水平持續(xù)下降(P<0.05)。具體結(jié)果見表1。

    表1 各組大鼠FBG、FINS水平比較Table 1 Comparison of FBG and FINS levels of rats in various groups(±s)

    表1 各組大鼠FBG、FINS水平比較Table 1 Comparison of FBG and FINS levels of rats in various groups(±s)

    ①P <0.05,與正常組比較;②P <0.05,與模型組比較;③P <0.05,與二甲雙胍組比較;④P <0.01,與同組干預(yù)0 d比較;⑤P <0.05,與同組干預(yù)15 d比較

    FBG(mmol?L-1)FINS(μU·mL-1)5.13±0.73 12.31±1.14①7.26±0.86①②③6.02±0.78①②5.88±0.75①②288.911<0.001組別正常組模型組鐵皮石斛多糖低劑量組鐵皮石斛多糖高劑量組二甲雙胍組F值P值鼠數(shù)(只)15 17 17 17 17干預(yù)0 d 5.30±1.67 18.80±1.91①18.90±1.90①18.80±1.89①18.60±1.91①191.394<0.001干預(yù)15 d 5.20±1.60 21.40±2.01①④16.70±1.71①②③④15.50±1.61①②④15.10±1.62①②④275.488<0.001干預(yù)30 d 5.50±1.31 23.50±1.91①④⑤14.30±1.56①②③④⑤12.40±1.41①②④⑤12.10±1.61①②④⑤467.760<0.001

    2. 2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C水平比較 血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組血清TG、TC、LDL-C 水平升高,HDL-C水平降低(P<0.05);與模型組比較,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組血清TG、TC、LDL-C水平降低,HDL-C水平升高(P<0.05);鐵皮石斛多糖高劑量組血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見表2。

    表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平比較Table 2 Comparison of serum TG,TC,LDL-C and HDL-C levels of rats in various groups (±s,mmol·L-1)

    表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平比較Table 2 Comparison of serum TG,TC,LDL-C and HDL-C levels of rats in various groups (±s,mmol·L-1)

    ①P <0.05,與正常組比較;②P <0.05,與模型組比較;③P <0.05,與二甲雙胍組比較

    組別正常組模型組鐵皮石斛多糖低劑量組鐵皮石斛多糖高劑量組二甲雙胍組F值P值HDL-C 1.79±0.18 0.72±0.08①0.96±0.10①②③1.29±0.13①②1.31±0.13①②69.419<0.001鼠數(shù)(只)77777 TG 0.67±0.08 1.52±0.16①1.32±0.14①②③1.02±0.11①②0.98±0.10①②50.311<0.001 TC 2.14±0.31 3.42±0.35①3.13±0.32①②③2.78±0.31①②2.73±0.31①②15.792<0.001 LDL-C 0.59±0.07 1.35±0.14①1.12±0.15①②③0.83±0.09①②0.84±0.09①②47.754<0.001

    2.3 各組大鼠血清SOD活性、MDA水平比較 大鼠血清SOD 活性、MDA 水平組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組血清SOD活性降低,MDA水平升高(P<0.05);與模型組比較,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組血清SOD活性升高,MDA水平降低(P<0.05);鐵皮石斛多糖高劑量組SOD 活性、MDA 水平與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見表3。

    表3 各組大鼠血清SOD活性、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD activity and MDA level of rats in various groups(±s)

    表3 各組大鼠血清SOD活性、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD activity and MDA level of rats in various groups(±s)

    ①P <0.05,與正常組比較;②P <0.05,與模型組比較;③P <0.05,與二甲雙胍組比較

    MDA(nmol·mL-1)1.58±0.23 3.76±0.38①3.22±0.33①②③2.75±0.28①②2.70±0.28①②49.115<0.001組別正常組模型組鐵皮石斛多糖低劑量組鐵皮石斛多糖高劑量組二甲雙胍組F值P值鼠數(shù)(只)77777 SOD(U·mL-1)389.68±40.23 246.51±28.56①287.57±32.36①②③337.64±34.51①②340.42±35.29①②17.796<0.001

    2.4 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 正常組肝細(xì)胞形態(tài)正常清晰,排列規(guī)則有序,組織結(jié)構(gòu)完整。模型組出現(xiàn)大量肝細(xì)胞水腫壞死現(xiàn)象,組織結(jié)構(gòu)紊亂,排列不均。鐵皮石斛多糖低劑量組有少量肝細(xì)胞水腫壞死,細(xì)胞排列紊亂,病理表現(xiàn)較模型組改善。鐵皮石斛多糖高劑量組和二甲雙胍組肝細(xì)胞形態(tài)、排列及組織結(jié)構(gòu)正常,個別肝細(xì)胞水腫壞死,病理表現(xiàn)較模型組明顯改善。見圖1。

    圖1 各組大鼠肝臟組織病理表現(xiàn)比較(HE染色法,×100)Figure 1 Comparison of liver histopathologic manifestations of rats in various groups(by HE staining,×100)

    2. 5 各組大鼠肝臟組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)水平比較 p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)水平組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組肝臟組織p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR 蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組比較,鐵皮石斛多糖低、高劑量組和二甲雙胍組肝臟組織p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR 蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.05);鐵皮石斛多糖高劑量組肝臟組織p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)水平與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而IRS2、PI3K、AKT 蛋白相對表達(dá)水平組間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見表4、圖2。

    圖2 各組大鼠肝臟組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of relative protein expression levels of IRS2,p-IRS2,PI3K,p-PI3K,AKT,p-Akt and mTOR in liver tissues of rats in various groups

    表4 各組大鼠肝臟組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of relative protein expression levels of IRS2,p-IRS2,PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,mTOR in liver tissues of rats in various groups(±s)

    表4 各組大鼠肝臟組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白相對表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of relative protein expression levels of IRS2,p-IRS2,PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,mTOR in liver tissues of rats in various groups(±s)

    ①P <0.05,與正常組比較;②P <0.05,與模型組比較;③P <0.05,與二甲雙胍組比較

    組別正常組模型組鐵皮石斛多糖低劑量組鐵皮石斛多糖高劑量組二甲雙胍組F值P值mTOR 1.01±0.11 0.38±0.05①0.60±0.06①②③0.84±0.09①②③0.85±0.09①②86.060<0.001鼠數(shù)(只)8 10 10 10 10 IRS2 1.01±0.11 1.01±0.11 1.02±0.12 1.01±0.11 1.02±0.12 0.022 0.999 p-IRS2 0.99±0.11 0.39±0.05①0.61±0.07①②③0.82±0.09①②0.83±0.09①②72.865<0.001 PI3K 1.22±0.16 1.24±0.15 1.21±0.17 1.22±0.16 1.23±0.17 0.049 0.995 p-PI3K 0.98±0.10 0.38±0.05①0.62±0.07①②③0.83±0.09①②0.84±0.09①②78.485<0.001 AKT 1.41±0.17 1.42±0.16 1.40±0.17 1.41±0.16 1.42±0.18 0.025 0.999 p-AKT 1.21±0.17 0.61±0.11①0.82±0.12①②③0.99±0.12①②1.01±0.14①②26.819<0.001

    3 討論

    糖尿病發(fā)病機制復(fù)雜,多數(shù)患者伴有血脂代謝異常,胰島素在調(diào)節(jié)血糖過程中發(fā)揮了重要的作用,可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路,參與葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪合成過程,調(diào)節(jié)糖脂代謝[13]。PI3K/AKT 信號通路是胰島素的下游分子通路,與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運有關(guān)[14]。IRS2 是維持胰島β 細(xì)胞功能的重要信號蛋白,胰島素與胰島素受體結(jié)合后,使得IRS2 酪氨酸位點磷酸化,磷酸化的IRS2 酪氨酸殘基與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85 結(jié)合,進而激活下游的PI3K,活化的PI3K 將磷脂酰肌醇磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸,并作為其第二信使激活A(yù)KT,活化的AKT 激活mTOR 的表達(dá),抑制糖異生限速酶的表達(dá),減少糖異生,降低血糖[15]。蔡羽[16]研究表明,上調(diào)PI3K/AKT 信號通路中IRS2、PI3K、AKT、p-AKT 的表達(dá),可有效改善糖脂代謝,減輕肝臟、胰腺和腎臟組織損傷,減少氧化應(yīng)激。陸梓華等[17]研究表明,上調(diào)IRS2、PI3K、AKT2 的表達(dá)與調(diào)節(jié)2 型糖尿病大鼠糖脂代謝異常狀態(tài)有關(guān)。另外,有研究證實,通過激活PI3K/AKT通路,可減少肝臟細(xì)胞脂質(zhì)新生,緩解高脂血癥模型大鼠肝臟脂質(zhì)沉積[18]。

    本研究結(jié)果顯示,經(jīng)鐵皮石斛多糖治療后的糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、MDA水平降低,HDL-C、SOD 水平升高,肝臟組織病理學(xué)變化得到改善,且高劑量鐵皮石斛多糖與鹽酸二甲雙胍療效無明顯差異,提示鐵皮石斛多糖可降低血糖,改善脂代謝,促進胰島素正常分泌,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。另外,本研究結(jié)果亦顯示,經(jīng)鐵皮石斛多糖治療后的糖尿病大鼠肝臟組織p-IRS2、p-PI3K、p-AKT、mTOR 蛋白表達(dá)上調(diào),表明脂代謝相關(guān)指標(biāo)得到明顯改善,提示鐵皮石斛多糖可能是通過激活PI3K/AKT 信號通路,改善脂代謝。

    綜上所述,鐵皮石斛多糖可改善糖尿病大鼠脂代謝異常,其可能是通過激活PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮作用的。

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