解郁健脾補(bǔ)腎方對(duì)大鼠高催乳素血癥的干預(yù)作用

鄧芳， 高修安， 許麗綿

（1.佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

高催乳素血癥（hyperprolactinemia）是指血清催乳素（prolactin，PRL）＞25 μg/L。女性常常表現(xiàn)為月經(jīng)過少、閉經(jīng)，甚至不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等，嚴(yán)重影響生殖健康[1-2]。目前治療高催乳素血癥，西醫(yī)首選療效確切的溴隱亭；因垂體微腺瘤引起的高催乳素血癥，常選擇手術(shù)治療。但臨床上，約12%的患者難于耐受溴隱亭所引起的頭暈、幻覺等副作用，且其停藥后復(fù)發(fā)率高[3]，而手術(shù)治療存在垂體功能降低、下丘腦損傷等并發(fā)癥，治療費(fèi)用多難以承受。因此，有必要探尋更經(jīng)濟(jì)安全的治療方法。中醫(yī)學(xué)在治療高催乳素血癥方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。本課題組前期應(yīng)用疏肝法、溫腎法治療高催乳素血癥，取得了一定的療效[4-5]，為進(jìn)一步探討解郁健脾補(bǔ)腎方對(duì)高催乳素血癥的干預(yù)作用，本研究復(fù)制了高催乳素血癥大鼠模型進(jìn)行分子水平研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 60只SPF級(jí)6周齡SD雌性大鼠，體質(zhì)量（200 ± 10）g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，室溫控制在22～24 ℃，濕度45%～65%，換氣次數(shù)10～15次/h，每日照射明光12 h、暗光12 h。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1. 2 藥物 解郁健脾補(bǔ)腎方由柴胡15 g、白芍10 g、麥芽10 g、凌霄花10 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、茯苓10 g、桑寄生15 g、杜仲10 g、巴戟天10 g組成。上述中藥飲片由佛山市婦幼保健院中藥房提供，所有藥材均由高修安教授鑒定為正品，符合《中國(guó)藥典》2015年版[6]規(guī)定。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室煎煮并濃縮，保存于2～8 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 試劑與儀器 溴隱亭（匈牙利吉瑞藥廠，進(jìn)口藥品批號(hào)：H20160170）；滅吐靈（甲氧氯普胺）（湖北萬得化工有限公司生產(chǎn)，CAS號(hào)：4093-35-0）；PRL、雌二醇（E2）、人促卵泡生成素（FSH）放射免疫分析試劑盒（北方生物技術(shù)研究所）；轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子5（STAT5）抗體（北京百奧萊博公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗體（北京中西華大公司）。SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀（美谷分子公司）；TL988-IV實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（上海啟前電子科技有限公司）；紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司）；AlphaImager HP 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)AlphaInnotech 公司）；計(jì)算機(jī)圖像分析儀（Image-Pro Plus Analysis Soft ware）。

1.4 動(dòng)物分組、造模與給藥 將60只大鼠隨機(jī)選10 只作為正常組，其余50 只大鼠構(gòu)建高催乳素模型。造模方法[7]：皮下注射滅吐靈（多巴胺受體阻斷劑）50 mg/kg，每日1 次，連續(xù)注射10 日。依據(jù)文獻(xiàn)[8]，PRL值為正常參考值的3倍以上，即可判定造模成功。造模第11 天取血測(cè)量血清PRL 水平，均＞100 μg/L，則提示造模成功。將全部造模成功的50 只大鼠，隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性藥物組，中藥低、中、高劑量組，每組10 只。于實(shí)驗(yàn)第12～21 天進(jìn)行藥物干預(yù)：按照“人與動(dòng)物體表面積折算等效劑量比率表”，陽(yáng)性藥物組給予溴隱亭2.0 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予解郁健脾補(bǔ)腎方12.6、25.2、50.4 g·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日2次（早晚8時(shí)），共灌胃10 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 采集標(biāo)本 行大鼠陰道涂片示排卵后，用100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，保存于-20 ℃的冰箱中。摘取卵巢組織剝除干凈周圍的脂肪，存于-80 ℃的冰箱中。

1. 5. 2 檢測(cè)血清PRL、FSH、E2水平 采用放射免疫法檢測(cè)血清PRL、E2、FSH水平，具體操作方法按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)卵巢組織STAT5 的表達(dá) 提取卵巢組織蛋白后，制膠、上樣、電泳處理，電轉(zhuǎn)移、膜封閉，用TBS-T 洗滌膜10 min×3 次，轉(zhuǎn)移至雜交袋，滴加一抗4 ℃孵育過夜；再用TBS-T洗滌膜10 min×3次，轉(zhuǎn)移至新的雜交袋，滴加二抗37 ℃孵育1 h；TBS-T繼續(xù)洗滌膜10 min × 3 次，膜表面用電化學(xué)發(fā)光液（ECL）覆蓋，聚偏氟乙烯（PVDF）膜每cm2至少需要0.125 mL ECL 液才能基本被覆蓋。包好，蛋白吸附面向上，放入X 光盒中曝光數(shù)分鐘后，立刻浸入顯影液，出現(xiàn)條帶顯影后清水漂洗，浸入定影液中定影、晾干，掃描分析并保存。

1.5.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)催乳素受體（PRLR）mRNA 表達(dá) 獲取卵巢RNA 提取物，進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)與PCR。離心管內(nèi)加入以下物質(zhì)3 μL RNA、1 μL Oligo（dT）引物、9.5 μL ddH2O進(jìn)行DEPC 定容；70 ℃水浴5 min 后置于冰上，離心后繼續(xù)加入5 μL 5×Buffer、5 μL dNTP、0.5 μL Ribonuclease Inhibitor、1 μL M-MLV RT；短暫離心后42 ℃水浴60 min 再70 ℃水浴10 min，在離心管內(nèi)加入1.5 μL cDNA、0.5 μL濃度為10 pmol/μL引物1、0.5 μL 濃度為10 pmol/μL 引物2、10 μL SYBR-Green Mix、ddH2O 補(bǔ)水至20 μL。PCR 程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性10 min，再94 ℃15 s、60 ℃1 min、72 ℃10 min共45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)定量結(jié)果。PCR引物信息見表1。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1. 6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組大鼠血清PRL 水平比較 表2 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的血清PRL 值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組PRL 值明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥各劑量組血清PRL 值與陽(yáng)性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清PRL水平比較Table 2 Comparison of serum PRL level of rats in various groups（±s）

表2 各組大鼠血清PRL水平比較Table 2 Comparison of serum PRL level of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組陽(yáng)性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組PRL（ng·mL-1）20.20±3.01 97.60±2.17①17.10±1.37②18.30±1.06②17.30±1.34②17.50±1.08②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

2.2 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較 表3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的E2、FSH值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物治療組E2、FSH 值明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥各劑量組血清E2、FSH 值與陽(yáng)性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清E2、FSH比較Table 3 Comparison of serum E2 and FSH levels of rats in various groups（±s）

表3 各組大鼠血清E2、FSH比較Table 3 Comparison of serum E2 and FSH levels of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組陽(yáng)性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FSH（mIU·mL-1）7.17±0.18 3.81±0.15①5.12±0.10②5.04±0.13②5.89±0.36②5.20±0.15②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 E2（pg·mL-1）72.10±1.79 40.10±2.38①53.50±2.37②55.40±1.71②66.80±2.15②56.80±2.30②

2.3 各組大鼠卵巢組織STAT5蛋白表達(dá)比較 表4、圖1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組卵巢組織STAT5 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組卵巢組織STAT5 蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥中劑量組卵巢組織STAT5 蛋白表達(dá)水平明顯高于陽(yáng)性藥物組，但仍低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠卵巢組織STAT5蛋白電泳條帶Figure 1 Electrophoresis bands of STAT5 protein in ovarian tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠卵巢組織STAT5表達(dá)比較Table 4 Comparison of STAT5 protein expression in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

表4 各組大鼠卵巢組織STAT5表達(dá)比較Table 4 Comparison of STAT5 protein expression in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性藥物組比較

STAT5 1.04±0.27 0.54±0.10①0.69±0.12①②0.78±0.13①②0.97±0.20①②③0.87±0.18①②組別正常組模型組陽(yáng)性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

2.4 各組大鼠卵巢組織PRLR mRNA表達(dá)比較 表5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組卵巢組織PRLR mRNA 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組卵巢組織PRLR mRNA 表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥中劑量組PRLR mRNA 表達(dá)水平明顯高于陽(yáng)性藥物組，但仍低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 各組大鼠卵巢組織PRLR mRNA表達(dá)比較Table 5 Comparison of PRLR mRNA expression in ovarian tissue of rats in various groups（±s）

表5 各組大鼠卵巢組織PRLR mRNA表達(dá)比較Table 5 Comparison of PRLR mRNA expression in ovarian tissue of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性藥物組比較

PRLR mRNA相對(duì)表達(dá)量1.09±0.20 0.39±0.06①0.50±0.04①②0.45±0.07①②0.67±0.10①②③0.52±0.12①②組別正常組模型組陽(yáng)性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

3 討論

催乳素（PRL）是一種重要的內(nèi)分泌激素，垂體外合成PRL 的部位主要在子宮內(nèi)膜，它通過相關(guān)信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜的血管生成與分化，支持黃體功能，并與子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)[9]。卵泡液中PRL的濃度與雌激素E2濃度相關(guān)，PRL基因缺失可使E2水平低下，竇狀卵泡個(gè)數(shù)少，囊胚不易著床[10]。PRL發(fā)揮生殖調(diào)節(jié)功能依賴于PRLR，PRLR表達(dá)的部位主要有3 個(gè)：非孕期分泌期子宮內(nèi)膜、蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)、卵巢組織[11-12]。適當(dāng)濃度的PRL與PRLR結(jié)合，可調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞FSH受體的表達(dá)，促進(jìn)卵泡發(fā)育及孕酮的生成。PRL/PRLR介導(dǎo)蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子5（STAT5）信號(hào)傳導(dǎo)途徑廣泛參與細(xì)胞增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)過程，是多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子傳導(dǎo)信號(hào)的重要途徑[13]，PRL 和PRLR 結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)JAK2，STAT5是JAK2作用的底物，STAT5亦是PRL 生成的重要因子[14]。PRL/PRLR-JAK2/STAT5 傳導(dǎo)通路，活化STAT5 反式作用因子，廣泛參與子宮內(nèi)膜血管生成、分化，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)及排出，維持黃體[15-16]，上調(diào)子宮內(nèi)膜α2 巨球蛋白、ERα、ERβ 的表達(dá)，參與蛻膜退化與重建[17]。已有研究表明：高催乳素血癥可抑制E2的分泌，同時(shí)降低E2受體的敏感性，不能形成排卵前的雌激素高峰影響排卵，使子宮內(nèi)膜容受性降低，黃體功能下降，影響卵泡的發(fā)育及排出[18]；高催乳素血癥亦可改變PRL/PRLR-JAK2/STAT5 通路效應(yīng)，降低孕激素酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制FSH 粒層細(xì)胞芳香化酶和雌激素分泌，可導(dǎo)致月經(jīng)紊亂及卵巢功能降低[7，19]。

高泌乳素血癥并無對(duì)應(yīng)的中醫(yī)學(xué)病名，其病因病機(jī)及辨證分型認(rèn)識(shí)多有不同。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，該病病機(jī)主要為腎氣不足、肝郁氣滯、脾胃運(yùn)化失常，涉及腎、脾、肝等臟腑，往往與氣滯、痰濕、血瘀相關(guān)，各因素互根互用[5]。本課題組綜合文獻(xiàn)研究與臨床經(jīng)驗(yàn)，擬制解郁健脾補(bǔ)腎方，方中柴胡入肝膽經(jīng)，疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣，白芍疏肝理氣、柔肝養(yǎng)血，二者配伍可加強(qiáng)疏肝解郁之效；麥芽健脾消食，凌霄花散結(jié)、活血化瘀；黨參入脾經(jīng)，健脾益肺，益氣生津，白術(shù)健脾燥濕化痰，固表止汗，茯苓健脾和胃，利水滲濕，黨參、白術(shù)、茯苓合用健脾和胃，增強(qiáng)體質(zhì)；桑寄生入肝腎經(jīng)，補(bǔ)肝腎，通經(jīng)絡(luò)，杜仲常配巴戟天以補(bǔ)腎、壯筋骨、祛風(fēng)濕。諸藥合用，共奏解郁健脾補(bǔ)腎之功，同時(shí)有行氣、化痰、祛瘀之效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)：柴胡含有的柴胡皂苷、柴胡醇、α-菠菜甾醇，均有護(hù)肝、保肝之效，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝損傷亦有防治作用[20]；白芍中的白芍苷可以刺激卵巢顆粒細(xì)胞生成甾體類激素，亦有保肝、護(hù)肝的作用[21]；麥芽含有的麥角類化合物可結(jié)合下丘腦及其受體，類似多巴胺激動(dòng)劑樣作用，使泌乳素釋放因子增強(qiáng)，抑制PRL 分泌[22]；黨參、茯苓、白術(shù)有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能[23]；桑寄生、巴戟天可促進(jìn)下丘腦產(chǎn)生GnRH，增加垂體對(duì)GnRH 及LH-RH 的敏感性，進(jìn)而刺激FSH、LH 抑制PRL 的產(chǎn)生，促進(jìn)卵泡發(fā)育，提高血中E2的水平，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌平衡[24-25]。

本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組PRL值明顯升高，E2、FSH 水平，STAT5 蛋白、PRLR mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，中藥各劑量組PRL值均明顯降低，E2、FSH水平，STAT5 蛋白、PRLR mRNA 表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）。表明高催乳素血癥大鼠卵巢組織PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子表達(dá)下降，可引起下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂，抑制性激素的分泌；經(jīng)解郁健脾補(bǔ)腎方治療，PRL 水平降低，PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號(hào)通路相關(guān)蛋白PRLR、STAT5 的表達(dá)增強(qiáng)，且與PRL 濃度有關(guān)。

綜上所述，解郁健脾補(bǔ)腎方可以有效改善高催乳素血病，提高PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子PRLR、STAT5 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育，誘導(dǎo)排卵，從根本上調(diào)整性腺軸的功能，增強(qiáng)卵巢的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，體現(xiàn)出中醫(yī)藥治療該病的優(yōu)勢(shì)和前景。