超聲波輔助鈴蘭總強(qiáng)心苷提取工藝的優(yōu)化*

黃泰奇，李成成，朱 銳，黃啟東，金衛(wèi)華

（武漢東湖學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430212）

強(qiáng)心苷是由強(qiáng)心苷配基與糖類縮合成的苷類，常見于夾竹桃科、百合科的植物中。自上世紀(jì)30年代地高辛被成功分離起，已經(jīng)有多種強(qiáng)心苷用于治療心力衰竭及某些心律失常，但由于強(qiáng)心苷有效劑量與中毒劑量接近，故其應(yīng)用受到限制[1]。但近些年來發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用[2，3]，強(qiáng)心苷類化合物的應(yīng)用再次受到關(guān)注。

鈴蘭（Convallaria keiskei Miq.）為百合科鈴蘭屬植物,別名山谷百合。具有藥用、觀賞價值[4]。鈴蘭花含揮發(fā)油等芳香物質(zhì)，可制作香料并應(yīng)用于食品及日化工業(yè)。鈴蘭含有強(qiáng)心苷、皂苷等活性成分，其中，鈴蘭毒苷曾用于急性及慢性心力衰竭，近些年來還發(fā)現(xiàn)其有抗衰老的功能[5]。陳玉昆等人以鈴蘭毒苷為標(biāo)準(zhǔn)品，探究出苯-乙醇（9∶1）為提取溶劑的鈴蘭毒苷提取純化工藝，但溶劑中苯為第一類致癌物質(zhì)，且工藝中溶劑消耗量大、萃取時間長，并只針對鈴蘭毒苷一種強(qiáng)心苷設(shè)計(jì)提取工藝，可能導(dǎo)致其他有效強(qiáng)心苷因此流失。因此，筆者結(jié)合超聲波提取，采用毒性較低的乙醇、乙酸乙酯、石油醚、水等溶劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)、多因素實(shí)驗(yàn)探究最佳提取條件，確定80%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶10、超聲提取時間120min、提取溫度70℃為鈴蘭總強(qiáng)心苷最佳提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

I3型紫外-可見分光光度計(jì)（海能儀器）；KQ-100DE超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲波儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；分析天平（梅特勒-托利多）。

地高辛標(biāo)準(zhǔn)品（東京化成工業(yè)株式會社）；乙醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）、苦味酸等試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)所用材料為鈴蘭（Convallaria keiskei Miq.）的全草，產(chǎn)自遼寧撫順。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系 取地高辛標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，加60%乙醇溶解并定容至25mL制成標(biāo)準(zhǔn)液。量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，60%乙醇定容至1mL，每種濃度標(biāo)準(zhǔn)液加入Baljet試劑（1%苦味酸溶液與1mol·L-1NaOH溶液按照95∶5體積比混合）4mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30min，在495nm波長下測吸光值[6，7]，得回歸方程y=3.1043x+0.0211，R=0.9994，說明地高辛標(biāo)準(zhǔn)品在0～0.24mg·mL-1的濃度下有良好線性關(guān)系。結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard Curve

2.1.2 樣品溶液制備方法 鈴蘭全草粉碎，過100目篩，稱取2.0000g，20mL 60%乙醇30℃超聲提取3次，每次超聲提取30min，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，殘液加10%Pb（Ac）2溶液2mL沉淀過濾去除色素，加飽和K2SO4溶液2mL沉淀多余的Pb（Ac）2，乙醇定容至25mL（乙醇終濃度為60%），取0.5mL加60%乙醇定容至1mL即為樣品溶液。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)液0.45mL，60%乙醇定容至1mL，按2.1.1中方法重復(fù)6次測定吸光值，測定結(jié)果見表1。

由表1可見，吸光值的RSD為0.11%，說明儀器精密度良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of precision experimental

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 量取2.1.2中樣品溶液1mL，按2.1.1中方法顯色，每隔5min測一次吸光值，測定測定結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of stability experimental

由表2可知，吸光值RSD為1.78%，說明30～55min內(nèi)吸光值較穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 量取6份2.1.2中樣品溶液1mL，按2.1.1中方法測定吸光值，測定結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of repetitive experimental

由表3可知，吸光值RSD為0.95%，說明該法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收實(shí)驗(yàn) 稱取一定量已知含量的鈴蘭全草樣品6份并加入一定量地高辛標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1.2中方法制備樣品液，按2.1.1中方法測定吸光值，計(jì)算回收率，測定結(jié)果見表4。

由表4可知，平均回收率為98.48%，RSD為2.06%[8]。

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Result of recovery experimental

2.2 溶劑種類對總強(qiáng)心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末8份，分別加入乙醇20mL，濃度分別為20%、40%、60%、80%和無水乙醇，石油醚-乙酸乙酯（1∶9）、乙酸乙酯、水，30℃超聲提取3次，每次30min，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結(jié)果見圖2。

圖2 溶劑種類對總強(qiáng)心苷提取率的影響Fig.2 Effect of solvents type on extraction rate

由圖2可知，說明80%乙醇為最佳提取溶劑，因此，選擇80%乙醇做進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 料液比對總強(qiáng)心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末10份，分別加入4、5、6、7、8、9、10、11、12、13倍量80%乙醇30℃超聲提取3次，每次超聲提取時間為30min，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結(jié)果見圖3。

由圖3可知，1∶11為最佳料液比，因此，選擇1∶11料液比做進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 料液比對總強(qiáng)心苷提取率的影響Fig.3 Effect of liquid to material ratio on extraction rate

2.4 時間對總強(qiáng)心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末6份，加入11倍量80%乙醇30℃超聲提取3次，每次超聲提取時間分別為30、60、90、120、150、180min，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對總強(qiáng)心苷提取率的影響Fig.4 Effect of time on extraction rate

由圖4可知，120min為最佳提取時間，因此，選擇120min做進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.5 溫度對總強(qiáng)心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末6份，加入11倍量80%乙醇分別在30、40、50、60、70、80℃下超聲提取3次，每次超聲提取時間為120min，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著溫度升高提取率也不斷增大，70℃提取率最高，但80℃迅速下降，可能是溫度過高導(dǎo)致部分強(qiáng)心苷水解。

圖5 提取溫度對總強(qiáng)心苷提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

2.6.1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（33）正交實(shí)驗(yàn)以探究各因素對總強(qiáng)心苷提取率的影響，表5為各因素水平。

表5 正交實(shí)驗(yàn)各因素水平表Tab.5 Level table of each factor in orthogonal experiment

2.6.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析由SPSS 23軟件完成。結(jié)果中P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Result of orthogonal experiment

由表6可知，溫度是影響總強(qiáng)心苷提取率的主要因素，其次為時間及料液比，且計(jì)算優(yōu)選水平組合與實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)水平組合相吻合，即最佳因素水平組合為料液比1∶10時，70℃條件下提取120min。

表7為正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果。

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.7 Result of variance analysis in orthogonal experiment

由表7可知，溫度對提取率的影響達(dá)到了顯著水平，時間和料液比沒有達(dá)到顯著水平，故實(shí)際提取過程中應(yīng)注意對溫度的控制。

3 結(jié)論

（1）單因素實(shí)驗(yàn)所用溶劑中，以80%乙醇提取效果最好，40%、60%乙醇次之，最佳提取條件為料液比1∶11，70℃超聲波提取3次，每次120min，此條件下制得的樣品液吸光值為0.638，換算為鈴蘭藥材中總強(qiáng)心苷含量為0.25%，與文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的0.2%含量基本相符。

（2）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取條件為料液比1∶10時，70℃條件下提取120min，重復(fù)3次，而單因素實(shí)驗(yàn)中料液比最佳條件是1∶11，但根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，料液比這一因素對提取率的影響不顯著，因此，以正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。

相比于陳玉昆等人使用苯-乙醇（9∶1）提取48h，本工藝通過超聲波輔助，將原48h的提取時間縮短為6h，顯著提高了萃取效率，且使用了低毒的80%乙醇代替了價格較高的含苯有毒溶劑，減少有毒溶劑對操作者的危害。但根據(jù)2.5中溫度對提取率影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溫度到達(dá)80℃時提取率迅速下降，原因可能是提取溶劑中含水，高溫導(dǎo)致強(qiáng)心苷內(nèi)酯環(huán)水解，故實(shí)際提取溫度不宜過高。綜上所述，本工藝具有高效、環(huán)保、低成本等優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)生產(chǎn)。