溫度、碳氮源對(duì)竹黃菌絲生長(zhǎng)特性的影響

游華建 張德利 賀宗毅 邢康康 陳仕江

（重慶市中藥研究院，重慶 400060）

竹黃是竹黃真菌（Shiraia bambusicolaP.Henn）寄生于箭竹屬（Sinarundinaria Nakai）和短穗竹屬（Brachystachyum Keng）植物枝條上形成的子座[1]，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycetes）、核菌綱（Pyrenomycetes）、球殼目（Sphaeriales）、肉座菌科（Hypocreaceae）、竹黃屬（Shiraia）。始載于唐代《食療本草》，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、鎮(zhèn)靜、化痰止咳和補(bǔ)中益氣的作用，民間常用來治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、虛寒胃痛、坐骨神經(jīng)痛、跌打損傷、氣管炎、小兒驚風(fēng)和急性肝炎等癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、保肝護(hù)肝、保護(hù)心血管、光敏殺傷腫瘤細(xì)胞等多種功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、生物農(nóng)藥和食品色素等研究領(lǐng)域[3]。竹黃子座含有竹紅素，有優(yōu)良的殺死腫瘤細(xì)胞和抑制艾滋病毒的作用，并且是一種新型的光活化農(nóng)藥和潛在的光電轉(zhuǎn)化材料，在世界范圍內(nèi)正被廣泛研究[4]。

我國(guó)野生竹黃資源長(zhǎng)期處于自生自滅的狀態(tài)，隨著現(xiàn)代城鎮(zhèn)化建設(shè)發(fā)展，近些年來市場(chǎng)對(duì)竹黃的需求量迅速增長(zhǎng)，野生竹黃被大量采集利用同時(shí)，其生境被嚴(yán)重破壞，野生資源逐年減少，日漸枯竭。研究人員近年來開展了竹黃的資源[4]、生物學(xué)[5]、液體發(fā)酵[6]、固體發(fā)酵[7]等研究，但尚未實(shí)現(xiàn)人工栽培，還需要對(duì)其生物學(xué)特性等進(jìn)行更深入的研究。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同溫度和不同碳、氮源培養(yǎng)基條件，觀察其對(duì)竹黃菌絲體生長(zhǎng)的影響，以期篩選適合竹黃菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，為制備竹黃菌種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株分離自安徽野生竹黃，經(jīng)分子鑒定確定為藥用真菌竹黃（Shiraia bambusicolaP.Henn）。采用斜面PDA 培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面后備用。

1.2 培養(yǎng)溫度

將竹黃接種于PDA 培養(yǎng)基平板后，分別置于30 ℃、25 ℃、20 ℃、15 ℃、10 ℃等5 種恒溫條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)10 次。

1.3 供試培養(yǎng)基配方及碳、氮源

碳源培養(yǎng)基：碳源10 g、馬鈴薯浸粉10g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL。供試碳源共5 種，其中單糖為葡萄糖、果糖，雙糖為乳糖、蔗糖，多糖為可溶性淀粉。

氮源培養(yǎng)基：氮源5 g、馬鈴薯浸粉10 g、葡萄糖10 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL。供試氮源分有機(jī)氮和無機(jī)氮，共9 種，其中有機(jī)氮源為蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麥芽浸膏、蛹粉，無機(jī)氮源為尿素、硫酸銨、磷酸二氫銨、硝酸鉀。

將上述配方處理接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)10 次。

1.4 試驗(yàn)方法

供試培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿（直徑90 cm）經(jīng)高溫高壓滅菌0.5 h 后使用，將培養(yǎng)基倒入玻璃培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后，挑取竹黃菌菌塊接種于培養(yǎng)基中央位置。待菌絲萌發(fā)后，每天測(cè)量記錄菌落直徑，觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)、顏色、密度等，直至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。觀察過程中一旦發(fā)現(xiàn)污染的培養(yǎng)皿，須及時(shí)拿出，以免污染擴(kuò)散至其他培養(yǎng)皿。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度的菌絲生長(zhǎng)情況

不同培養(yǎng)溫度處理對(duì)竹黃平板菌絲形態(tài)、色澤、生長(zhǎng)速度等的影響見表1和圖1。從表1可以看出，不同溫度對(duì)菌絲的生長(zhǎng)速度有較大影響，而對(duì)其形態(tài)影響較小。當(dāng)培養(yǎng)溫度為15 ℃、20 ℃、25 ℃時(shí)，隨著溫度升高，菌絲生長(zhǎng)速度顯著加快，其中在20 ℃和25 ℃下，菌絲潔白、長(zhǎng)勢(shì)健壯，呈匍匐狀，密度較大，前緣整齊，并產(chǎn)生同心輪帶，底部分泌較多黑色素。說明在這兩個(gè)溫度條件下，竹黃菌絲細(xì)胞能保持較旺盛的生長(zhǎng)能力。在15 ℃和30 ℃下，菌絲生長(zhǎng)速度顯著降低，長(zhǎng)勢(shì)稀疏。而在10 ℃時(shí)，低溫導(dǎo)致菌絲細(xì)胞代謝障礙，菌絲幾乎不生長(zhǎng)，也未產(chǎn)生黑色分泌物。

圖1 竹黃菌絲體在不同溫度下生長(zhǎng)表現(xiàn)（培養(yǎng)21 天）

表1 不同溫度條件下竹黃菌絲體生長(zhǎng)速度及菌落特征

2.2 不同碳源處理的菌絲生長(zhǎng)情況

由表2和圖2可見，添加乳糖的培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)速度較快、長(zhǎng)勢(shì)較好，但邊緣稀疏，背面中心位置有直徑約0.5 cm 的黑色區(qū)域，為5 個(gè)處理中最小，說明產(chǎn)生黑色分泌物較少。添加淀粉的培養(yǎng)基，菌落背面黑色區(qū)域與乳糖相當(dāng)，呈現(xiàn)明顯的輪紋，但整體長(zhǎng)勢(shì)較乳糖好，菌絲更濃密。添加葡萄糖、果糖、蔗糖的3 個(gè)氮源處理，菌絲體的生長(zhǎng)速度相似，但均慢于乳糖和淀粉處理，菌落邊緣菌絲較濃密，背面黑色分泌物較多。

圖2 竹黃菌絲體在不同碳源培養(yǎng)基下生長(zhǎng)表現(xiàn)

表2 不同碳源條件下竹黃菌絲體生長(zhǎng)速度及菌落特征

2.3 不同氮源處理的菌絲生長(zhǎng)情況

由表3、圖3可知，有機(jī)氮源中，添加蛋白胨的培養(yǎng)基菌絲體生長(zhǎng)速度快，其次為添加蛹粉，兩者沒有顯著性差異，但均顯著快于其余有機(jī)氮源處理。蛹粉處理的菌落背面呈明顯的環(huán)紋，黑、黃兩種顏色層次分明。其余3 個(gè)有機(jī)氮源處理的菌落形態(tài)和背面顏色有所不同，以酵母浸膏和麥芽浸膏處理的輪紋較為明顯，酵母浸膏處理的菌落背面分泌黑色物質(zhì)較少。

圖3 竹黃菌絲體在不同氮源培養(yǎng)基下生長(zhǎng)表現(xiàn)

表3 不同氮源條件下竹黃菌絲體生長(zhǎng)速度及菌落特征

無機(jī)氮源方面，硫酸銨處理的菌絲生長(zhǎng)速度快，但與硝酸鉀、磷酸二氫銨處理間沒有顯著性差異，而尿素處理的菌絲幾乎不生長(zhǎng)。菌落形態(tài)，硝酸鉀處理呈現(xiàn)的環(huán)狀條紋最明顯，硫酸銨處理的菌絲體長(zhǎng)勢(shì)最好，菌落背面呈明顯環(huán)狀條紋，黑色、黃色顏色層次分明。

3 小結(jié)與討論

竹黃菌屬偏高溫型菌類，在15～25 ℃培養(yǎng)溫度下均能生長(zhǎng)，且隨著溫度升高而長(zhǎng)速加快，以25 ℃下生長(zhǎng)較快，在10 ℃條件下幾乎不生長(zhǎng)，30 ℃條件下生長(zhǎng)緩慢。竹黃能利用多種碳源物質(zhì)，但同化吸收效果有差異，多糖和雙糖優(yōu)于單糖，菌絲生長(zhǎng)較佳的碳源為淀粉和乳糖，但乳糖培養(yǎng)基的黑色分泌物較少，可能會(huì)影響竹紅素的分泌。

竹黃菌絲對(duì)不同氮源物質(zhì)的同化效果以蛋白胨最好；蛹粉、硫酸氨對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；酵母浸膏、麥芽浸膏、硝酸鉀、磷酸二氫銨等則對(duì)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育有一定抑制作用；以尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌絲不生長(zhǎng)。表明竹黃菌絲對(duì)有機(jī)氮源的利用效果好于無機(jī)氮源。