鴨圓環(huán)病毒病研究進(jìn)展

蔣山翊， 張?zhí)焯欤?田 琴， 張明華， 周碧君，2，3， 程振濤，2，3， 王開功，2，3*， 文 明，2，3*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025； 3. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

鴨圓環(huán)病毒病(Duck circovirus disease，DuCVD)是由鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus， DuCV)引起鴨的1種傳染性疾病[1]。各日齡和品種的鴨均可感染，病鴨表現(xiàn)羽毛發(fā)育不良、生長遲緩、呼吸困難、體重減輕和貧血等癥狀[2]。DuCV通過侵害免疫系統(tǒng)而引起免疫抑制，降低機(jī)體的免疫功能，使被感染的鴨更容易受到其他病原微生物的侵害，導(dǎo)致鴨群的死亡率增加[3]。DuCV于2003年首次在德國發(fā)現(xiàn)，之后在匈牙利、美國、中國、韓國和波蘭等國家陸續(xù)報道有感染病例，提示其流行范圍在不斷擴(kuò)大[4～6]。傅光華等[7]于2008年首次在我國大陸地區(qū)番鴨中檢測到DuCV感染。隨后在福建、浙江、江西、廣東、山東等省陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有DuCV感染病例[8]。近年來，DuCV在我國鴨群中的感染及與其他病原混合感染情況呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)將DuCV的相關(guān)研究情況概述如下，為科學(xué)防控和進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 病原學(xué)特征

DuCV是圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬的成員，無囊膜，單鏈環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，衣殼呈二十面體對稱，直徑為15～16 nm，是目前已知最小的鴨病毒。目前還不能對DuCV進(jìn)行分離培養(yǎng)，所以對其病原學(xué)特征的研究十分有限。

2 病毒基因組結(jié)構(gòu)

DuCV是1種單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小約1.99 kb，主要包含3個主要的開放閱讀框ORF1、ORF2、ORF3。ORF1和ORF2分別編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白和核衣殼Cap蛋白。ORF3位于ORF1的互補(bǔ)鏈，并編碼ORF3蛋白。ORF3蛋白是1種新發(fā)現(xiàn)的具有凋亡活性的病毒蛋白，其生物學(xué)功能尚不清楚[9，10]。通過使用dottup程序進(jìn)行基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)在DuCV基因組的Rep和Cap基因之間有1個4重串聯(lián)重復(fù)序列(QTR)，此特征不存在于其他圓環(huán)病毒基因組[11]。目前DuCV有 2種基因型：DuCV-1和DuCV-2。DuCV-1又分為4個子類型DuCV-1a、DuCV-1b、DuCV-1c和新定義的子類型DuCV-1d；DuCV-2分為3種亞型，包括DuCV-2a、DuCV-2b、DuCV-2c[12]。Hong Y-T等[13]在北京鴨中建立實(shí)驗(yàn)性DuCV基因型1(DuCV-1)感染，發(fā)現(xiàn)DuCV-1對免疫器官造成了廣泛損害，可導(dǎo)致免疫抑制。

3 流行病學(xué)

據(jù)報道，中國鴨群中無癥狀DuCV感染率很高，且長期養(yǎng)殖的種鴨血清DuCV陽性率顯著高于短期養(yǎng)殖的肉鴨群，表明DuCV可通過水平傳播[14]。劉少寧[15]在2006—2007年從我國養(yǎng)鴨業(yè)比較集中的山東、江蘇、四川、福建、廣東5個省份的36個鴨群中采集臨床發(fā)病的343只病(死)鴨病料進(jìn)行檢測，死鴨中DuCV陽性率為81.63%(280/343)，各省群體陽性率為94.44%(34/36)，表明我國鴨群中DuCV的感染較為普遍。Liu Hao等[9]在2018—2019年用PCR方法對廣東、廣西、云南的4種鴨進(jìn)行DuCV流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果鴨群DuCV的總感染率約為36.91%，其中大于4周齡的鴨比小于4周齡的鴨更容易受到感染。Niu Xinxin等[16]發(fā)現(xiàn)DuCV-1和DuCV-2主要集中在東部沿海城市和遷徙中的中國野鴨；通過PCR檢測2013—2016年11種野鴨的189個樣品，陽性率為2.12%，表明攜帶DuCV的野鴨可能是鴨圓環(huán)病毒病流行和傳播的重要因素。

4 致病性

DuCV主要引起宿主的免疫抑制，從而導(dǎo)致繼發(fā)感染或多重感染。該病毒可在胸腺、肝臟、脾臟、腎臟和法氏囊中持續(xù)存在，其中法氏囊是DuCV復(fù)制的最主要器官。DuCV感染造成淋巴組織損傷，進(jìn)而引起體液免疫和細(xì)胞免疫功能下降，這種免疫抑制加大了其他病原感染的概率。根據(jù)Li P等[17]的研究，新型小鵝瘟病毒和DuCV混合感染在華東地區(qū)較普遍。田琴等[18]研究顯示，在貴州省某養(yǎng)殖場的花邊鴨DuCV和小鵝瘟病毒混合感染率顯著高于單獨(dú)DuCV感染率。

5 臨床癥狀

感染DuCV的病鴨常表現(xiàn)生長遲緩、羽毛凌亂、呼吸困難、食欲不振、生長發(fā)育不良等癥狀。DuCV經(jīng)呼吸道侵入氣管后，造成呼吸系統(tǒng)組織逐漸腫大，最后氣管阻塞導(dǎo)致呼吸困難。

6 病理變化

陸曉[2]等對感染DuCV的死鴨進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)土黃色的斑塊，膽汁稀薄且明顯減少；部分死鴨的淋巴組織嚴(yán)重受損，法氏囊中的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)大范圍損傷、壞死，組織細(xì)胞常伴有不良增生現(xiàn)象。最近的1項(xiàng)研究表明，DuCV在自然和生殖情況下還可誘發(fā)原發(fā)性硬化性膽管炎[19]。

7 診斷

目前對于DuCV的診斷主要通過實(shí)驗(yàn)室方法，常用方法包括熒光定量PCR、多重PCR、間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))及LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法)。

7.1 熒光定量PCR熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的1種高度靈敏的核酸定量檢測技術(shù)，其特點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快。Wang Yong等[20]成功開發(fā)了1種基于SYBR Green I的雙鏈實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，用于檢測DuCV的Rep基因和新型小鵝瘟病毒的VP1基因。該法可根據(jù)2種病毒的不同Tm值區(qū)分這 2種病毒，比常規(guī)PCR技術(shù)更加靈敏。

7.2 多重PCR多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對不同基因特異性引物，同時擴(kuò)增出多個目的基因片段的PCR技術(shù)。許宗麗等[21]根據(jù)鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和DuCV基因的保守序列設(shè)計(jì)了3對特異性引物，預(yù)擴(kuò)增片段分別為823、576、338 bp，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和DuCV的三重PCR檢測方法，特異性好、敏感性高。

7.3 間接ELISA間接ELISA是利用抗原抗體之間特異性結(jié)合的特性，對抗原或抗體進(jìn)行定量或定性檢測的方法，適合大批量樣品同時檢測。Cap作為DuCV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，是血清學(xué)診斷試劑盒開發(fā)的主要候選靶標(biāo)。Yang Cui等[22]通過重組Cap蛋白建立了間接ELISA方法(Cap-ELISA)。Cap-ELISA的優(yōu)化結(jié)果表明，包被抗原的最佳濃度和血清稀釋率分別為每孔19.5 ng和 1∶1 280；用于陽性樣品檢測的Cap-ELISA臨界值為0.145，靈敏度臨界值為1∶25 600，對DuCV抗血清的檢測具有特異性。與其他用于檢測DuCV的技術(shù)相比，使用重組蛋白作為包被抗原建立間接ELISA更為實(shí)用、經(jīng)濟(jì)且可用于大規(guī)模臨床檢測。

7.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增該方法是1項(xiàng)核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)，具有高度的特異性和敏感性，而且可在等溫條件下于30～60 min內(nèi)完成，可用于檢測臨床樣品的快速直接診斷[23]。趙光遠(yuǎn)等[24]根據(jù)GenBank中DuCV基因序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了6對特異性引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了1種適用于DuCV的LAMP技術(shù)，表現(xiàn)出較高的靈敏度，DNA最小檢出限為10 fg，是常規(guī)PCR的1 000倍。

8 綜合防控措施

8.1 科學(xué)管理加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免產(chǎn)生各種應(yīng)激，控制合理的飼養(yǎng)密度及通風(fēng)換氣。遵循預(yù)防為主、防重于治、全進(jìn)全出的防疫及飼養(yǎng)原則。

8.2 嚴(yán)格檢疫種鴨的引進(jìn)必須經(jīng)過嚴(yán)格檢疫，防止從疫區(qū)引進(jìn)種鴨、鴨苗、種蛋，引進(jìn)的種鴨、鴨苗要隔離觀察14 d以上，確認(rèn)健康之后方可混合入群。其次，因?yàn)轼喢庖咭种菩约膊∧壳吧袩o有效的疫苗和藥物進(jìn)行防治，所以養(yǎng)殖過程中應(yīng)及時隔離、堅(jiān)決淘汰發(fā)病和帶毒鴨，病死鴨要統(tǒng)一無害化處理，力爭凈化本場的DuCV等病原微生物。定期對鴨舍進(jìn)行排查，對已經(jīng)出現(xiàn)病鴨的鴨舍應(yīng)將病鴨迅速隔離，針對該區(qū)域做好消毒清潔工作，在確保完全清潔、通風(fēng)、消毒之后才能購入新鴨[25]。

8.3 定期消毒消毒是消滅病原的有效措施。DuCV雖然能夠與多種病原微生物發(fā)生混合感染，造成鴨大范圍發(fā)育不良，但其抵抗外界物理、化學(xué)因素的能力不強(qiáng)，所以加強(qiáng)消毒能夠有效殺滅 DuCV。對于畜禽空舍，一般選用高錳酸鉀與30%福爾馬林混合進(jìn)行熏蒸消毒處理，每立方米用30%福爾馬林14～42 mL、高錳酸鉀7～21 g、水7～21 mL，熏蒸7～42 h。2%福爾馬林溶液可用于器械消毒，器械置于藥液中浸泡1～2 h即可。處理排泄廢物可選用濃度10%福爾馬林溶液。

8.4 控制飼料喂養(yǎng)優(yōu)質(zhì)飼料是增強(qiáng)鴨抵抗疾病能力的基礎(chǔ)，首先一定要保證飼料來源于正規(guī)渠道，對于腐敗、變質(zhì)的飼料要堅(jiān)決淘汰；其次飼料成分及投喂時間也要嚴(yán)格控制，科學(xué)配制飼料，飼料中添加多種維生素，提高鴨的抗病能力和自身免疫功能。

8.5 疫苗免疫開發(fā)高效的疫苗是預(yù)防DuCV感染的關(guān)鍵策略。Zhaolong Li等[3，26]用開發(fā)的DuCV滅活疫苗在體外PBMC(外周血單核細(xì)胞)培養(yǎng)中繁殖，在番鴨體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了更高的抗體，表現(xiàn)出很強(qiáng)的保護(hù)能力，通過DuCV攻擊沒有表現(xiàn)典型的羽毛異常和矮化癥狀，體重的倍數(shù)變化也沒有明顯差異，免疫效果好。Huang Juan等[27]開發(fā)了1種帶有Cap編碼基因的DuCV DNA疫苗，可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)并產(chǎn)生抗體；通過測量Cap特異性抗體和相關(guān)的細(xì)胞因子水平，在體內(nèi)評估這種DNA疫苗的免疫原性，結(jié)果表明該疫苗可以誘導(dǎo)顯著的特異性免疫反應(yīng)，以保護(hù)鴨免受DuCV攻擊。

9 小結(jié)與展望

DuCVD是1種免疫抑制性疫病，對鴨等水禽造成嚴(yán)重危害。某些細(xì)菌、真菌感染及一些營養(yǎng)性疾病與DuCV感染的臨床表現(xiàn)相似，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷。另外，由于DuCV常以隱性感染的方式存在，養(yǎng)殖過程中通常不會對DuCV進(jìn)行檢測，這為DuCV的傳播創(chuàng)造了條件。DuCV侵害鴨的免疫系統(tǒng)后常導(dǎo)致鴨群更容易發(fā)生其他病原的感染，所以對DuCV進(jìn)行鑒別診斷的同時，也要考慮其他傳染病原感染的可能性。為了更好地防控DuCV感染，應(yīng)對該病毒的病原學(xué)和生物學(xué)特性，以及對動物免疫系統(tǒng)的影響進(jìn)行不斷深入研究，探究該病毒具體的分子致病機(jī)制，研制出更有效的新型疫苗，以減少其對我國養(yǎng)鴨業(yè)的危害。