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    高效液相色譜-質譜法同時測定養(yǎng)殖魚肌肉中8種激素*

    2021-11-30 13:21:14吳彩妮曾軍杰梅光明
    廣州化工 2021年22期
    關鍵詞:雌酚標準溶液乙腈

    龍 舉,吳彩妮,曾軍杰,梅光明

    (1 浙江省海洋水產研究所,水產品加工與質量安全研究室,浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室,浙江 舟山 316021;2 浙江伊渼源檢測科技有限公司,浙江 舟山 316100)

    激素是指由體內的某一細胞、腺體或者器官所產生的可以影響機體內其他細胞活動的化學物質[1]。由于激素化合物能提高飼料轉化率,縮短動物生長周期,促進動物生長繁殖等作用近年來被廣泛用于水產養(yǎng)殖[2],被用以提高養(yǎng)殖魚的經(jīng)濟效益。激素在養(yǎng)殖魚中違規(guī)使用,造成了嚴重的安全隱患。激素隨著食用養(yǎng)殖魚肉進入人體會干擾機體激素平衡,導致性早熟,機體中水、電解質、蛋白質、脂肪和糖的代謝紊亂,以及提高乳腺癌、前列腺癌等發(fā)病率,對健康具有潛在的危害[3],會影響人體生理活動[4]。歐盟規(guī)定在飼料中禁止使用雄激素[5],中國明確規(guī)定了部分激素在動物性源性食品中的最大殘留量[6]。

    目前檢測激素類殘留的方法主要有酶聯(lián)免疫法[7]、高效液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質譜法 (LC-MS /MS)[12]。結合方法穩(wěn)定性、靈敏度、工作效率等因素,選用LC- MS /MS 作為本實驗檢測方法,建立了同時測定養(yǎng)殖魚肌肉中酚類、天然生成及人工合成雌激素以及環(huán)境激素的新方法,該方法前處理方法簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好,能快速高效的檢測養(yǎng)殖魚肌肉中多種激素的殘留,同時也為其他動物源性食品中的獸藥多殘留分析提供參考。

    1 實 驗

    1.1 材料與試劑

    水產樣品共120個,隨機在浙江省內寧波、溫州、杭州、舟山等地市場及養(yǎng)殖場購買。

    試劑:標準品包括諾龍、群伯龍、甲基睪酮、己烷雌酚、己二烯雌酚、雙酚A、雌二醇 (純度98.5%~99.0%) 德國Dr公司;馬拉硫磷購自國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心;氯化鈉(分析純),阿拉丁試劑公司;乙腈、甲醇、甲酸(色譜純)Sigma公司;試驗用水為Milli-Q超純水。

    標準溶液配制:分別取8種激素標準品用甲醇配制成100.0 μg/mL的標準儲備液;臨用時用甲醇配制成1 μg/mL的混合標準液,現(xiàn)用現(xiàn)配。用流動相將混合標準溶液稀釋成一系列濃度是標準溶液,待測。

    1.2 儀器與設備

    儀器:Waters Acquity 超高效液相色譜儀-高分辨-四級桿-飛行時間質譜儀(Waters Xevo G2-S QTof-MS)、AcquityTM型超高效液相色譜儀(UPLC)、Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質譜儀,美國Waters公司;渦旋振蕩器(IKAM S1),德國IKA公司;Eppendorf Centrifuge 5810高速離心機,德國Eppendorf公司;N-EVAP-45氮吹儀,美國Organomation公司;AL204型電子天平,瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

    1.3 樣品前處理

    準確稱取2.00 g(±0.01)樣品于50 mL離心管中,加入 0.7 g氯化鈉,再加5 mL乙腈,渦旋混勻,40℃超聲提取10 min后,在4 ℃下7000 r/min離心5 min,取上清液轉移至15 mL聚四氟乙烯離心管中。再用5 mL乙腈重復提取一次,合并后的上清液45 ℃氮氣吹干。加入1 mL 5 mmol乙酸銨水溶液-乙腈(90:10)復溶殘渣,加50 mg PSA,渦旋1.0 min,在4 ℃下7000 r/min離心5 min,取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后上機測定。

    1.4 色譜條件

    色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm); 柱溫40 ℃;樣品溫度25 ℃;進樣量5 μL;流速0.3 mL/min;流動相A為5 mmol乙酸銨水溶液,B為乙腈,梯度洗脫設置見表1。

    表1 8種激素梯度洗脫表Table 1 8 hormone gradient elution tables

    1.5 質譜條件

    離子源: 電噴霧正負離子源;掃描模式為Full Scan/MSE;檢測方式: 多反應監(jiān)測(MRM);毛細管電壓為3.0 kV;錐孔電壓為35 V; 離子源溫度為120 ℃;脫溶劑氣溫度為380 ℃;錐孔反吹氣為高純氮氣,流速為50 L/h;脫溶劑氣為高純氮氣,流速為600 L/h;運行時間為15 min。Source Acquisition Mode、Da Range及Collision Energy根據(jù)不同激素的特性選擇調試合適的條件,低碰撞為0V,高碰撞能為20~30 V;質量掃描范圍為100~1000 Da;采用2.0 μg/L亮氨酸腦啡肽(分子量為556.2771/554.2615(+/-))進行實時校準以保證目標物的質量數(shù)精度。錐孔電壓和碰撞能量等質譜多反應監(jiān)測實驗條件如表2所示。

    表2 8 種激素質譜多反應監(jiān)測實驗條件Table 2 8 hormones mass spectrometry multiple reaction monitoring experimental conditions

    2 結果與討論

    2.1 前處理條件的優(yōu)化

    實驗選擇乙腈作為提取試劑,比較了震蕩超聲提取及振蕩提取對養(yǎng)殖魚肌肉中8種激素的提取效果。如圖1所示,取同一草魚陰性樣本兩組,均加入100 μL 100 ng/mL的混合標準溶液,分別采用震蕩超聲提取及振蕩提取,經(jīng)試驗震蕩超聲提取時,己二烯雌酚回收率最低為70.2%,諾龍回收率最高為98.5%;振蕩提取時己群勃龍回收率最低為66.4%,馬拉硫磷回收率最高為86.2%,振蕩提取效果明顯不及震蕩超聲提取。

    由圖1可知震蕩加超聲提取方式的提取效果優(yōu)于振蕩提取。這是由于樣品基質含蛋白質以及水分含量高,成分復雜且分散,振蕩提取易使其粘壁對目標物造成損失。超聲提取利用機械效應和空化效應,來增加大分子運動速度以及頻率,從而提高介質的穿透力達到對目標物進行高效提取。

    圖1 兩種不同提取方式的回收率Fig.1 Recovery of two different extraction methods

    2.2 質譜條件的優(yōu)化

    采用注射泵連續(xù)進樣對8種激素進行分析,諾龍、群伯龍、馬拉硫磷、甲基睪酮采用ESI+模式,己烷雌酚、己二烯雌酚、雙酚A、雌二醇采用ESI-模式,對標準溶液分別進行一級質譜全掃描,得到每種激素的分子離子,對錐孔電壓及毛細管電壓進行優(yōu)化,確定準分子離子峰。通過子離子掃描,并對碰撞能量進行優(yōu)化,確定8種激素的定量及定性離子。

    2.3 色譜條件的優(yōu)化

    采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (50 mm×2.1 mm,1.7 μm),分別選擇乙腈-水、甲醇-水作為流動相同時分析8種激素的分離效果。實驗表明,乙腈-0.1%甲酸水可使諾龍、群伯龍、馬拉硫磷、甲基睪酮等4種激素(EIS+)出峰分離,且峰形良好,但不能使4種激素(EIS-)完全出峰。使用5 mmol乙酸銨水溶液-乙腈為流動相可使己烷雌酚、己二烯雌酚、雙酚A、雌二醇等4種激素出峰分離,峰形較好,且其他4種激素目標峰無明顯變化。故本實驗選擇5 mmol乙酸銨水溶液-乙腈為流動相分析8種激素,如圖2為各激素標準溶液的MRM色譜圖。

    圖2 8種激素標準溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 8 hormone standard solutions

    2.4 方法學驗證

    2.4.1 線性關系、檢出限及定量限

    用甲醇將8種激素標準使用稀釋成質量濃度為1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/L混合標準工作溶液,以外標法獲取標準曲線。進樣后,以目標物的峰面積(y)對應的質量濃度(x)分別繪制標準曲線,計算其相關系數(shù)。方法在2.0~100 μg/kg范圍內8種激素線性良好,相關系數(shù)r2均大于0.99。分別以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比確定方法檢出限(LOD)及定量限(LOQ),檢出限范圍為0.3~0.5 μg /kg,定量限范圍為0.9~1.5 μg /kg,具體結果詳見表3。

    表3 8種激素的線性方程、LOD和LOQTable 3 Linear equations, LOD and LOQ of 8 hormones

    2.4.2 回收率及精密度

    通過配制基質工作溶液來消除基質效應的影響。分別采用空白草魚、大黃魚樣品制作基質提取液和加標回收實驗,根據(jù)目標藥物在質譜中響應的強弱加入不同濃度的混合標準系列,得到每種物質的線性范圍及相關系數(shù)。每個加標濃度平行測定6次,按本方法進行檢測,得到回收率為70.2%~86.2%,相對標準偏差(RSD)為3.56%~8.58%。大黃魚中8種激素的方法學實驗結果見表4。

    表4 8種激素的線性范圍、回收率、相對標準偏差Table 4 Linear range, recovery, RSDs of 8 hormones

    2.4.3 實際樣品檢測

    表5 養(yǎng)殖魚肌肉中激素類檢出情況表Table 5 Table of hormone detection in Farmed fish muscle

    用此方法對浙江省不同地域、季節(jié)和品種的養(yǎng)殖魚肌肉中激素類藥物開展了篩查和定量檢測工作。共計采集和篩查養(yǎng)殖魚樣品120個,包括鳙魚、多寶魚、石斑魚、大黃魚、烏鱧、草魚、鱸魚、黃鱔、鯉魚、黃顙魚、烏鱧、黑鯛共12種。樣品均取肌肉可食部位,勻漿后冷凍保存。在120個樣品中共篩查出2例樣品共2種激素,經(jīng)確證和UPLC-MS/MS定量檢測后確定為2個激素參數(shù)有檢出樣品。養(yǎng)殖魚肌肉中激素類檢出情況見表5。

    3 結 論

    建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定養(yǎng)殖魚肌肉中8種激素的檢測方法,并優(yōu)化了前處理方法及色譜、質譜條件,整體實驗操作簡便、耗時短,此方法靈敏度高、穩(wěn)定性好,能快速高效的定性篩查和定量分析大批量樣品中的多種激素類藥物,也為保障養(yǎng)殖魚類水產品質量安全提供技術支持。

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