甘油磷酰膽堿的分析、制備及純化研究進展

鄒俊康，鮑宗必，楊啟煒，張治國，任其龍，楊亦文

（1 浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江 杭州 310027；2 浙江大學(xué)衢州研究院，浙江 衢州 324000）

甘油磷酰膽堿的全名為L-α-甘油磷酰膽堿（L-α-glycerylphosphorylcholine，GPC），是人體內(nèi)卵磷脂分子上的兩條脂肪酸鏈水解后的產(chǎn)物[1]。早在1945 年Schmidt 等[2]便從牛的胰臟中提取出了GPC 粗品，第一次確認(rèn)了GPC 的結(jié)構(gòu)。由于其結(jié)構(gòu)特性，GPC有助于細(xì)胞膜磷脂的合成，從而增強細(xì)胞膜的流動性，同時還會對脂質(zhì)代謝產(chǎn)生積極影響[3]。

GPC能夠穿過血腦屏障，為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成提供原料，從而提高海馬體中乙酰膽堿的水平，有效地改善人體膽堿狀態(tài)[4]，并且通過增加神經(jīng)細(xì)胞的形成、減少神經(jīng)元的死亡來支持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能[5-6]，提升大腦認(rèn)知能力[7]。此外，GPC能提高基因的表達水平，預(yù)防由衰老造成的認(rèn)知功能下降[8]，這也使得GPC 在治療阿爾茲海默癥[9-10]、健忘癥[11]、腦缺血型中風(fēng)[12]等精神性疾病上有明顯的效果。Strifler等[13]證實GPC是一種靶向線粒體的化合物，能夠減少嚙齒動物體內(nèi)自由基含量，減輕缺血再灌注引起的損傷和炎癥反應(yīng)[3,14]，具有改善心血管疾病的作用[15]。Szabó等[16]發(fā)現(xiàn)GPC能降低輻射誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)損傷和致死性，顯示出防輻射的作用。Izu 等[17]發(fā)現(xiàn)GPC 與S-腺苷蛋氨酸同時使用能夠降低糖尿病模型小鼠的血糖，顯示出治愈糖尿病的可能性。

GPC被認(rèn)為是無毒且安全的化合物[18]，不僅具備治愈各種疾病的潛力，還被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和化妝品等行業(yè)，展現(xiàn)出良好的市場前景[19]。但是，國內(nèi)高純度藥用GPC 幾乎全部依賴進口。為進一步促進GPC 相關(guān)產(chǎn)品的研究，本文綜述了最近幾年來GPC 的研究現(xiàn)狀，重點介紹了GPC 的分析、制備和純化技術(shù)的研究進展。

1 GPC的分析方法

早在1990 年，意大利就有GPC 上市，波蘭、阿根廷、韓國、俄羅斯等國家也陸續(xù)上市了該藥品。但在國內(nèi)，GPC作為一種三類新藥，還沒有上市。在研究GPC 及其相關(guān)產(chǎn)品時，建立全面的分析檢測方法至關(guān)重要。趙艷艷[20]采用核磁共振波譜（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）等光譜學(xué)技術(shù)系統(tǒng)地測定了GPC的光譜學(xué)數(shù)據(jù)，確定了GPC 的結(jié)構(gòu)及化學(xué)位移歸屬（圖1）。這些傳統(tǒng)方法能定性分析GPC 的存在與否，但無法準(zhǔn)確檢測出GPC 的含量。分析檢測得到GPC 濃度和純度對于探究其產(chǎn)品的質(zhì)量更為重要，因此，下面將從薄層色譜法、核磁共振譜法、滴定法和液相色譜法來綜述GPC的定量分析方法。

圖1 GPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其化學(xué)位移歸屬[20]

1.1 薄層色譜法

薄層色譜由于其操作簡便、快速等特點，通常被用作一種定性檢測方法，用于判斷待測物是否存在。為測定磷酰膽堿酯交換反應(yīng)所制備的GPC 含量，杜旭佳[21]用硅膠粉和甲基纖維素鈉混合物作為固定相，用5mol/L 的氨水和正丙醇的混合液作為展開劑，按照正丙醇、氨水體積比13∶7配制。經(jīng)過點樣、展開和染色后使用Adobe Photoshop 軟件對斑點的表面積進行計算，以GPC濃度為橫坐標(biāo)，斑點面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定GPC的濃度。但此方法對斑點表面積的計算誤差大，使所測得GPC 的濃度不準(zhǔn)確，可作為中控方法，判斷反應(yīng)過程中是否有GPC的生成。

1.2 核磁共振譜法

核磁共振譜法是對物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行定性分析的強有力工具，Billadello等[22]利用核磁共振磷譜定量分析了組織中的GPC 含量，此方法可以有效測定組織中GPC 的含量，且回收率較高，但此方法檢測結(jié)果的變異系數(shù)太大，導(dǎo)致所測得含量誤差大。為準(zhǔn)確分析大豆卵磷脂水解產(chǎn)物中各雜質(zhì)的含量，杜章斌等[23]利用核磁共振氫譜法準(zhǔn)確定位了GPC、卵磷脂（PC）和溶血磷脂（LPC）的特征質(zhì)子峰，并根據(jù)每個特征性質(zhì)子峰的相對面積與物質(zhì)的量的對應(yīng)關(guān)系計算出三種物質(zhì)的相對含量，此方法可有效避免樣品中水分對檢測結(jié)果的干擾，使測定結(jié)果更準(zhǔn)確。但核磁共振氫譜的圖譜較為復(fù)雜，并且測量特征性質(zhì)子峰的峰面積存在誤差，使得所測量的GPC含量不夠準(zhǔn)確。為提高測量的準(zhǔn)確率，黎玲玲等[24]成功建立核磁共振磷譜定量法，以磷酸三苯酯為內(nèi)標(biāo)，以MEOD-d4作溶劑，以（樣品/內(nèi)標(biāo)）的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，NMR 峰面積比為縱坐標(biāo)，建立零截距標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定藥品中GPC 的絕對含量。該方法簡便快捷、準(zhǔn)確可靠，物質(zhì)鑒定和定量分析可以同步完成。

GPC作為一種手性藥物，其兩種對映異構(gòu)體的生物利用度、代謝率，代謝產(chǎn)物以及毒性可能存在顯著差異，所以測定GPC 產(chǎn)品的光學(xué)純度是至關(guān)重要的。De Ferra 等[25]將GPC 的對映異構(gòu)體與手性硼酸在二甲基亞砜中進行反應(yīng)（圖2），形成兩種都含有兩個手性中心的非對映體硼酸酯，通過1H NMR 光譜觀察到這兩種非對映體硼酸酯的膽堿甲基和芐甲基所對應(yīng)的化學(xué)位移不同，從而根據(jù)相應(yīng)特征峰面積大小計算出L-α-GPC 對映體的光學(xué)純度。核磁共振譜法可用于GPC 的鑒定，也可用于測定最終得到的GPC產(chǎn)品的光學(xué)純度。

圖2 手性硼酸與外消旋GPC的反應(yīng)[25]

1.3 滴定法

《美國藥典2019》[26]采用直接滴定法來檢測從PC中提純的GPC，0.1mol/L高氯酸的乙酸溶液作為滴定劑，采用電位法判斷滴定終點，并計算消耗的滴定劑體積，用式(1)計算GPC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)P。

式中，VS為GPC 樣品滴定達到終點時消耗滴定劑的體積，mL；VB為空白滴定終點消耗滴定劑的體積，mL；NA為滴定劑的標(biāo)準(zhǔn)濃度，mEq/mL；F為等效系數(shù)，257.2mg/mEq；W為樣品質(zhì)量，mg。并規(guī)定計算值在98%～102%為GPC的合格標(biāo)準(zhǔn)。

劉丹等[27]采用非水電位滴定法，將高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為滴定劑，對GPC 樣品進行滴定，計算滴加滴定劑的體積V和所測量的電壓E，將一系列V、E值進行二級微商處理，用式(2)所示的內(nèi)插法計算滴定劑的用量。

式中，Vφ為滴定終點時標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；Va為二級微商為a時標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；a為二級微商為零前的二級微商值；b為二級微商為零后的二級微商值；ΔV為二級微商為a至二級微商為b所加標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL。

采用二級微商法計算滴定劑的體積更為準(zhǔn)確，求出的GPC 含量更為準(zhǔn)確，但是此方法在制備GPC樣品時用到了乙酸汞。黃祥元等[28]用乙酸代替乙酸汞溶液加入到GPC 樣品中，這樣既避免使用汞鹽，所得到的滴定突躍現(xiàn)象也更明顯。滴定法測量精度高，常用于提純得到的GPC 產(chǎn)品含量的測定，但是其檢測成本高、操作復(fù)雜，樣品中少量的酸性物質(zhì)也會引起誤差。

1.4 液相色譜法

在定量分析GPC 含量時，高效液相色譜法是最常用的一種方法。劉狄等[29]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD），采用硅膠上鍵合1,2-二羥基丙基官能團的Diol 正相硅膠柱為分析柱，甲醇-水為流動相，檢測了不同磷脂中PC 和GPC 的含量。但此方法的流動相中含有極性強的水，長期使用會對Diol正相柱造成損害，降低色譜柱的柱效，對檢測結(jié)果有影響。杜章斌等[30]采用Alltech Silica色譜柱，甲醇為流動相，檢測了PC水解液中的GPC 含量，此方法避免了極性強的水對色譜柱的傷害，增強了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Kielbowicz等[31]開發(fā)了一種高效液相色譜-電噴霧檢測器（HPLC-CAD）的檢測方法，采用硅烷基配體官能化的球形硅膠作為固定相，乙腈-甲醇-10mmol/L 乙酸銨溶液作為流動相，此方法有效檢測了PC、LPC 和GPC 的含量，但CAD 檢測器的基線不平穩(wěn)，雜峰很多，檢測結(jié)果誤差大。

為更準(zhǔn)確檢測PC 水解產(chǎn)物中GPC 及相關(guān)雜質(zhì)的含量，《美國藥典2019》[26]采用液相-示差折光法（LC-RID）和LC-ELSD 聯(lián)用來檢測提純物中雜質(zhì)的含量。LC-RID 是為了檢測GPC 提取物中甘油的含量，色譜柱為L14 柱（10μm 硅膠化學(xué)鍵合強堿性季銨鹽陰離子交換固定相），流動相為乙腈-水，測得甘油和GPC 的相對保留時間分別為0.6 和1.0，并且規(guī)定甘油含量小于0.5%為合格。LC-ELSD 法是為了檢測GPC 提取物中的其余有機雜質(zhì)，流動相按照以下方法配制，并按照表1中的時間進行梯度洗脫，可有效檢測出GPC 提取物中各有機雜質(zhì)的含量。

表1 流動相比例及其洗脫時間

為檢測化學(xué)合成的GPC 及相關(guān)雜質(zhì)的含量，傅超婷等[32]采用二元梯度洗脫程序，選取蒸發(fā)光散射檢測器，以甲酸銨的乙腈溶液作為流動相對GPC待測樣品進行第一液相色譜檢測，用陽離子交換色譜柱，檢測出雜質(zhì)甘油磷酰肌醇（GPI）、氯化膽堿和甘油的含量；以乙腈-水為流動相對GPC待測樣品進行第二液相色譜檢測，用氨基鍵合硅膠色譜柱，檢測出雜質(zhì)甘油磷酰乙醇胺（GPE）的含量。這種方法能全面有效地檢測GPC 樣品中雜質(zhì)的含量，能夠更好地控制GPC 產(chǎn)品的質(zhì)量。但此方法操作較為麻煩，需要切換兩次色譜柱和兩次流動相。陳東英等[33]利用極性硅膠柱作為色譜柱，甲醇-乙腈-緩沖鹽溶液為流動相，采用示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器或質(zhì)譜檢測器，能很好地檢測出磷脂、膽堿、氯化磷酰膽堿（PC-Cl）和GPC的含量，并且各有關(guān)物質(zhì)的分離度均大于1.5，峰形良好。液相色譜法是最常用的定量分析方法，可測定反應(yīng)液中GPC 及其相關(guān)雜質(zhì)的含量，還可以測定提純后得到的GPC產(chǎn)品的純度。

目前國內(nèi)沒有GPC 相關(guān)藥物、保健品、食品和化妝品的生產(chǎn)，只有生產(chǎn)GPC 原料藥的廠家，所以國內(nèi)沒有對GPC 的質(zhì)量規(guī)定。國際市場上，用于藥品、食品和保健品中的GPC 都是高純度的GPC，其質(zhì)量要求可參考美國藥典。化妝品中添加的GPC暫時沒有相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

《美國藥典》對GPC 的質(zhì)量要求如下：①滴定法計算得到GPC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98%～102%之間；②乙酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%，氯化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.02%，硫酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.02%，磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.005%、甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%。松醇、β-GPC、蔗糖、絲氨酸、GPE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都小于0.1%；③0.1g/mL 的GPC 溶液的旋光度在-2.4～-2.8 之間；④細(xì)菌總數(shù)不超過1000cfu/g，霉菌和酵母菌的總數(shù)不超過100cfu/g；⑤8.5g/100mL 或10g/100mL 的GPC 溶 液 的pH 在5.0～7.0 之 間；⑥GPC 固體水分含量小于1.0%，GPC 水溶液的水含量為14%～16%。

對各種分析方法的優(yōu)缺點進行了比較分析，如表2所示。在反應(yīng)過程中，可將薄層色譜法作為中控方法快速判斷反應(yīng)中是否有GPC 生成；進行定量分析時，液相色譜法是最常用的方法，可測定反應(yīng)液中GPC 的濃度，從而計算反應(yīng)收率。在分析提純所得GPC 產(chǎn)品的質(zhì)量時，其含量可用高精度的滴定法來測定，其相關(guān)雜質(zhì)的含量可用液相色譜法測定。但沒有一種檢測器能檢測出GPC 產(chǎn)品相關(guān)的全部雜質(zhì)，對于縮水甘油、氯甘油這類有機雜質(zhì)，需要RID 檢測器來檢測；對于GPE、GPI 這類雜質(zhì)，需要ELSD檢測器來檢測。所以，多種檢測器聯(lián)用才能有效測定GPC 中相關(guān)雜質(zhì)的含量，進一步判斷GPC的質(zhì)量是否符合要求。

表2 不同分析方法的比較

2 GPC的制備方法

GPC天然存在于生物物質(zhì)中，所以早期是通過分離純化技術(shù)從生物物質(zhì)中提取GPC 的。1945 年Schmidt 等[2]便從牛的胰臟中萃取、純化得到了GPC，并確定其結(jié)構(gòu)由膽堿和α-甘油磷酸組成的。但是生物物質(zhì)中GPC 含量極低，直接提取非常困難，產(chǎn)量很低。目前制備GPC 主要有水解磷脂類化合物和全化學(xué)合成兩種方法。

2.1 水解磷脂類化合物

工業(yè)上采用水解法制備GPC 的原料為大豆磷脂粉末或蛋黃粉，兩者的主要成分都是PC，PC的sn-1 脂肪酸酰基被水解得到sn-2-溶血磷酰膽堿（sn-2-LPC），再經(jīng)過?；詣愚D(zhuǎn)移得到sn-1-溶血磷酰膽堿（sn-1-LPC），最后水解掉剩余的脂肪酸?；傻玫紾PC，其反應(yīng)如圖3。

圖3 PC水解的反應(yīng)過程[34]

2.1.1 化學(xué)催化水解法

水解PC 常用的化學(xué)催化劑有金屬鈉、醇鈉[35-36]，化學(xué)催化水解的制備工藝簡單，容易規(guī)?；a(chǎn)，但GPC 的收率很低。PC 在離子交換樹脂[37]的催化下醇解的效果較好，但離子交換樹脂再生困難，并產(chǎn)生大量廢水，不適合工業(yè)應(yīng)用。為解決這些問題，Li等[38]考察了12種低沸點胺類催化劑的催化效果，發(fā)現(xiàn)在叔丁胺的催化下，PC 的轉(zhuǎn)化率可達到98%以上，并且這類低沸點催化劑可以在旋蒸回收甲醇時被同步回收，可實現(xiàn)重復(fù)利用。

但是，這些化學(xué)催化劑毒性較大，最終得到的GPC 產(chǎn)品中仍然會有少量殘留，使得GPC 產(chǎn)物的安全性存在問題。為了找到更好的催化劑，Li等[39]采用400℃下煅燒的硅酸鈉作為催化劑，在甲醇中催化PC 的水解，PC 最高轉(zhuǎn)化率能達到99.5%。由于硅酸鈉無毒，易于從人體排泄，所以可以作為生產(chǎn)GPC的良性催化劑。

2.1.2 生物酶水解法

與化學(xué)催化劑相比，生物酶的毒性更小，也更安全，具備用量少、催化效率高和易于回收等特點。此方法得到的GPC 適合用于藥物、食品和保健品等口服產(chǎn)品中，是PC水解反應(yīng)中研究的熱點。

Zhang 等[40]用磷脂酶A1（PLA1）作催化劑并加入輔助因子CaCl2增強PLA1的活性，GPC 的產(chǎn)率能達到94.5%。為進一步提高產(chǎn)率，Zhang 等[41]繼續(xù)用Thermo4S-3 作為生物催化劑，并用響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳反應(yīng)條件，將GPC 的最大產(chǎn)率提高到96.8%。但是，在水相體系中，PC的溶解度非常有限，導(dǎo)致GPC 的生產(chǎn)效率很低，難以在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。為解決上述問題，Lu 等[34]使用Tween 20作為表面活性劑來改善PC 在水相中的溶解度和分散性，大大縮短了反應(yīng)時間并提高了GPC的產(chǎn)量。

由于PC 在雙相介質(zhì)中的溶解度比在水中大得多，Bang 等[42]則考慮用雙相介質(zhì)來提高PC 的溶解度，以PLA1為生物催化劑在水-己烷的雙相介質(zhì)中催化PC 水解，使得GPC 的生產(chǎn)效率得到提高。但是，此方法的反應(yīng)時間為30h，反應(yīng)進行過于緩慢，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。Kielbowicz等[31]研究發(fā)現(xiàn)，堿性pH 環(huán)境可以同時促進?；w移和水解過程，為了進一步提高PLA1的催化效率，Li等[43]成功開發(fā)一種簡單的共沉淀方法將PLA1封裝在金屬表面活性劑納米復(fù)合材料（MSNC）中，并利用堿性的2-甲基咪唑（2-Melm）對這種材料進行改性，得到催化活性增強的2-Melm@PLA1/MSNC 催化劑（圖4）。這種復(fù)合材料具有堿性和兩親性，能夠使?；D(zhuǎn)移和酶水解在水-己烷的雙相體系中高效有序地進行，并且具備良好的穩(wěn)定性，重復(fù)利用不會影響其活性。

圖4 2-Melm@PLA1/MSNCPC的合成及催化過程[42]

為了使GPC 的品質(zhì)滿足食品添加劑的要求，Kim 等[44]將大豆卵磷脂置于食品級萃取溶劑正己烷-水的雙相介質(zhì)中，選擇Novozym435（諾維信脂肪酶435）催化其水解，過濾除去酶后所得濾液，通過雙相介質(zhì)的簡單相分離即可得到純度為98.6%的食品級GPC水溶液。

2.2 全化學(xué)合成法

縮水甘油或氯甘油與磷酰膽堿的鹽反應(yīng)生成GPC 的收率高（達到90%以上），反應(yīng)工藝簡單，是目前工業(yè)上最主流的合成路線。Park 等[19]以R-縮水甘油為原料，開發(fā)了兩種合成GPC 的反應(yīng)路線。路線1：R-縮水甘油先與苯甲醇進行開環(huán)反應(yīng)，后經(jīng)乙?；?、氫化，再與甲基苯磺酸膽堿和吡啶反應(yīng)生成乙酰甘油磷酰膽堿，最后脫去乙?；吹肎PC。路線2：S-縮水甘油與甲基苯磺酸膽堿直接磷酸化得S-縮水甘油磷酰膽堿，再經(jīng)過開環(huán)反應(yīng)即得GPC。路線2 是在路線1 的基礎(chǔ)上進行的改進，反應(yīng)路線更短，操作更簡單。

Song 等[45]利用環(huán)氧開環(huán)的原理，將R-縮水甘油與PC-Cl 在異丙胺的存在下進行親核加成制備GPC，此方法制備工藝簡單，但反應(yīng)收率偏低，而且反應(yīng)原料R-縮水甘油極不穩(wěn)定，保存條件苛刻，增加了生產(chǎn)成本。Lee等[46]在此基礎(chǔ)上，以R-氯甘油為原料，在低溫條件下與NaOH的醇溶液反應(yīng)生成R-縮水甘油，并立即將所制備的R-縮水甘油與PC-Cl以2∶1的物料比在50～60℃下反應(yīng)制備GPC，將反應(yīng)收率提高到70%～92%。Hwang等[47]利用此工藝路線，將450mmol PC-Cl溶解于甲醇中，依次加入900mmol 的KOH 和900mmol 的R-氯甘油，用一鍋法制備出GPC，反應(yīng)最大收率達到97%。此方法操作簡單，中間產(chǎn)物少，適用于工業(yè)生產(chǎn)。PC-Cl的價格較為昂貴，通常不作為工業(yè)生產(chǎn)的原料。劉振等[48]則利用磷酰膽堿鈣鹽（PC-Ca）與碳酸鉀水溶液反應(yīng)制備磷酰膽堿鉀鹽（PC-K），將PC-K 與R-氯甘油反應(yīng)制備GPC 粗品，此方法也避免用到不穩(wěn)定的R-縮水甘油，原料的穩(wěn)定性好且價格低，但是工藝操作比較復(fù)雜。尤家棟[49]利用R-氯甘油與NaOH 在乙醇中低溫制備R-縮水甘油，過濾掉析出的鹽后加入PC-Cl高溫回流反應(yīng)制備GPC，也具備很高的收率。

對各種制備方法的優(yōu)缺點進行了比較分析，如表3所示。全化學(xué)合成法制備GPC具備收率高、產(chǎn)品純度高、制備工藝完善的優(yōu)點；但起始原料昂貴，最終得到的GPC 產(chǎn)品中也會殘留一些基因毒性雜質(zhì)，對產(chǎn)品的品質(zhì)有嚴(yán)重影響。利用化學(xué)催化水解PC 同樣存在這些問題，化學(xué)催化劑是毒性物質(zhì)會影響產(chǎn)品在食品和藥物中的應(yīng)用。生物酶通常無毒無害，用生物酶水解PC 是制備食品級GPC 最好的方法，但此方法收率低，產(chǎn)品純度低，對除雜的要求很高，規(guī)模化生產(chǎn)難度大。

表3 不同制備方法的比較

3 GPC的純化方法

目前，市場要求GPC 產(chǎn)品的RID 純度達到99.65%，旋光度在-2.4～-2.72，且單一雜質(zhì)含量不能超過0.1%。但是，化學(xué)制備法會產(chǎn)生磷酰膽堿鹽、縮水甘油、氯甘油和甘油等雜質(zhì)，水解法會產(chǎn)生甘油磷酰乙醇胺（GPE）、甘油磷酰絲氨酸（GPS）、甘油磷酰肌醇（GPI） 等雜質(zhì)。因此，GPC的純化一直是一個難點。目前常用的純化方法就是溶劑萃取法、結(jié)晶法和柱色譜法。

對于化學(xué)法制備的GPC粗品，劉振等[48]先用活性炭脫色，再用丙酮萃取除去其中的有機溶劑，最后用D001 大孔強酸性樹脂和711 大孔強堿性樹脂混床柱脫鹽，可得到純度為99.8%的GPC產(chǎn)物。丁建飛[50]采用GPC在無水乙醇中結(jié)晶的方法除去GPC中的有機雜質(zhì)，得到的GPC純度能達到99.5%。于振鵬等[51]考察了醇類、酯類、酮類和乙腈的結(jié)晶除雜效果，所得GPC 晶體的純度都達到了99.5%以上。尤家棟[52]將反應(yīng)液用丙酮萃取，然后用陰性離子交換樹脂柱除去萃取液中的鹽分，最后在無水乙醇中結(jié)晶得到精制GPC。

對于水解PC 得到的GPC 粗品，周麗等[53]采用D113 吸附樹脂，將GPE 和鹽類雜質(zhì)除去，所得GPC純度達到97%。Bang等[42]先將濾液用乙醚萃取三次以除去游離脂肪酸（FFA），接著用硅膠柱除去殘留的FFA 和PC-Cl，從而得到純化的GPC。Zhang 等[54]使用D001 陽離子和D301-111 陰離子交換樹脂柱色譜法成功地將GPC 和GPE 分開，得到的GPC 純度為98.8%。王志強等[55]將水解的PC 反應(yīng)液直接進行氧化鋁柱層析，再用D001 大孔離子交換樹脂除去鹽分，所得GPC純度可達99%以上。

對各種純化方法的優(yōu)缺點進行了比較分析，如表4所示。在GPC的純化中，目前最重要的還是結(jié)晶法和柱色譜法，結(jié)晶法收率低，操作較為復(fù)雜，可作為產(chǎn)品純化的最終步驟；柱色譜法除雜效果好，但在除雜過程中會產(chǎn)生大量“三廢”，純化周期長，工業(yè)應(yīng)用成本高。因此，開發(fā)適用于工業(yè)生產(chǎn)的除雜方法非常重要。

表4 不同純化方法的比較

4 結(jié)語

人口老齡化是當(dāng)今世界發(fā)展的一個重要趨勢，老年人的精神健康問題也是全世界研究的熱點，GPC能提高海馬體中的乙酰膽堿水平，支持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能，預(yù)防衰老造成的認(rèn)知功能的下降，在中國這樣的老齡化社會中具備良好的市場前景。

在目前的分析方法中，液相色譜法是GPC 的定量分析最常用的方法，液相色譜配合多種檢測器聯(lián)用還能檢測各雜質(zhì)的含量。薄層色譜法可作為中控方法，判斷反應(yīng)過程中是否有GPC 的生成。核磁共振譜法可用于GPC 的鑒定，也可用于測定最終得到的GPC 產(chǎn)品的光學(xué)純度。滴定法測量精度高，常用于最終得到的GPC產(chǎn)品含量的測定。

在目前的制備方法中，全化學(xué)合成法制備GPC具備收率高、產(chǎn)品純度高、制備工藝完善的優(yōu)點；但起始原料昂貴，最終得到的GPC 產(chǎn)品中也會殘留一些基因毒性雜質(zhì)，對產(chǎn)品的品質(zhì)有嚴(yán)重影響。利用化學(xué)催化水解PC 同樣存在這些問題，這些化學(xué)催化劑同樣是毒性物質(zhì)，也會影響產(chǎn)品在食品上的應(yīng)用。生物酶通常無毒無害，用生物酶水解PC是制備食品級GPC最好的方法，但此方法收率低，產(chǎn)品純度低，對除雜的要求很高，規(guī)?；a(chǎn)難度大。

在目前的純化方法中，最常用的還是結(jié)晶法和柱色譜法：結(jié)晶法收率低，操作也較為復(fù)雜，可作為產(chǎn)品純化的最終步驟；柱色譜法除雜效果好，但在除雜過程中會產(chǎn)生大量“三廢”，純化周期長，工業(yè)應(yīng)用成本高。

在社會老齡化的背景下，GPC具有良好的市場前景。開發(fā)能規(guī)?；a(chǎn)GPC 的工藝路線，適用于工業(yè)生產(chǎn)的除雜方法是其關(guān)鍵和難點。