精子鞭毛蛋白以及精子表面蛋白17的研究進(jìn)展

唐 益，周 林，周宇鑫，劉 麗，趙璟璐，宮曉慶，遲長(zhǎng)鳳

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國(guó)家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022)

精子相關(guān)蛋白是一大類與精子發(fā)生和形成、精卵識(shí)別以及頂體反應(yīng)等受精活動(dòng)密切相關(guān)的蛋白。MARTINES-HEREDIA，et al[1]利用雙向凝膠電泳結(jié)合離子質(zhì)譜對(duì)人精子細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并根據(jù)這些蛋白在生理過(guò)程中所起的具體作用將其分為多種類型，包括與能量產(chǎn)生有關(guān)的蛋白，與mRNA 轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白，與蛋白質(zhì)在體內(nèi)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及結(jié)構(gòu)折疊有關(guān)的蛋白，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白，與細(xì)胞骨架的形成有關(guān)的蛋白，與鞭毛的形成以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的蛋白，甚至還包括很多未知功能的蛋白。隨著科技的進(jìn)步，隨著各種分離純化、克隆、定位研究方法與技術(shù)的發(fā)展，使我們能夠在更深層面對(duì)于這一類生物因子的生理功能以及作用機(jī)理有更加深入的認(rèn)識(shí)。

1 精子表面蛋白17

精子表面蛋白17(Sp17)最早是在兔精子中被發(fā)現(xiàn)的[2]，被認(rèn)為參與了精子的頂體反應(yīng)，是受精過(guò)程中的關(guān)鍵分子。而精子鞭毛蛋白最初定位于精子鞭毛鞘中，相關(guān)研究認(rèn)為它可能參與了精子尾部鞭毛結(jié)構(gòu)的形成以及功能。截至目前，眾多學(xué)者針對(duì)它們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、表達(dá)、定位以及功能方面的研究，并取得了豐富的成果。

1.1 理化性質(zhì)

1994 年RICHARDSON，et al[2]首次在兔精子中發(fā)現(xiàn)了Sp17的存在，通過(guò)G22C 抗體實(shí)驗(yàn)證明，Sp17 最早出現(xiàn)在頂體反應(yīng)開始之后，并利用重組蛋白rSp17 在體外受精的實(shí)驗(yàn)證明Sp17 能夠結(jié)合卵膜透明帶以及葡聚糖和硫酸葡聚糖。LEA，et al[3]克隆了人Sp17 基因的cDNA 全長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)編碼的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)它不含信號(hào)肽，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。WEN Ying，et al[4]利用免疫共沉淀的方法研究發(fā)現(xiàn)，在精子細(xì)胞完成獲能過(guò)程直至發(fā)生頂體反應(yīng)之前，從兔精巢中分離得到的Sp17 在泳道中呈現(xiàn)出由22～24 kDa 大小不同的三種蛋白構(gòu)成的蛋白三聯(lián)體，這樣的結(jié)果與RICHARDSON，et al[2]以及LEA，et al[3]通過(guò)SDS-PAGE 電泳得到的結(jié)果類似。然而，一旦對(duì)完成了獲能的精子細(xì)胞施以鈣離子刺激，其Sp17 氨基酸序列的C 端就會(huì)剪切掉部分序列，主要包括鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)即IQ 結(jié)構(gòu)域序列，從而產(chǎn)生大小為17～19 kDa的三聯(lián)體蛋白，并且隨著這種刺激作用的持續(xù)，分子量較大的三聯(lián)體蛋白數(shù)量逐漸減少，而同時(shí)分子量較小的三聯(lián)體蛋白數(shù)量逐漸增加。

LEA，et al[5]發(fā)現(xiàn)，Sp17 作為一種抗原在輸精管切除術(shù)后男性體內(nèi)迅速增多，并證明了Sp17 蛋白表面存在2 個(gè)免疫顯性線性B 細(xì)胞抗原表位，這一點(diǎn)與重組蛋白HSp17 在體內(nèi)的表達(dá)是不同的。ADOYO，et al[6]克隆得到了狒狒SP17cDNA 全長(zhǎng)序列，并在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種長(zhǎng)度為0.8～1.35 kD的cDNA 序列，它們?cè)?’非編碼區(qū)(UTR)存在差異，均編碼長(zhǎng)度為163 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，跟人的相似度達(dá)到97%，僅在靠近C 端的12 個(gè)氨基酸上存在不同。針對(duì)不同物種的Sp17 結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白中靠近N 端位置含有高度保守的DD CABYR SP17 結(jié)構(gòu)域以及分布于靠近C 端位置的一個(gè)或多個(gè)IQ 結(jié)構(gòu)域[7]，因此，Sp17 屬于鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族[8]。此外，其N 端的部分氨基酸序列在很大程度上跟CAMP 蛋白激酶A 調(diào)節(jié)亞基(PKA RII)高度相似[9]，氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)位于IQ 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸含有豐富的螺旋結(jié)構(gòu)，這也預(yù)示著鈣調(diào)素與鈣調(diào)蛋白結(jié)合域中的α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定可能具有某種天然的聯(lián)系[10-11]。而且不同物種Sp17 氨基酸鏈上均存在PEST 序列，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在其他含有鈣調(diào)蛋白結(jié)合域的蛋白質(zhì)中也存在這樣的結(jié)構(gòu)[12]。

1.2 組織表達(dá)特異性及生物學(xué)功能

O'RAND，et al[13-14]通過(guò)重組蛋白的實(shí)驗(yàn)證明，Sp17 可以與雌兔卵膜透明帶上的糖蛋白R(shí)45 或者R55結(jié)合，因此，推測(cè)Sp17 可能作為結(jié)合透明帶表面糖基的分子而參與到頂體反應(yīng)中，并促進(jìn)受精作用。ADOYO，et al[6]通過(guò)Northern blot的方法確定了Sp17 在精巢中特異性表達(dá)，并利用細(xì)胞免疫的方法證明Sp17 主要分布于精母細(xì)胞、精子以及生精上皮組織中。然而CHIRIVA-INTERNATI，et al[15]通過(guò)人體免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Sp17 不僅在雄性生殖系統(tǒng)中表達(dá)，在其它正常的組織中也會(huì)有微量表達(dá)，尤其在呼吸系統(tǒng)特別是纖毛細(xì)胞中有較高的表達(dá)量[16]。

CAMP 結(jié)構(gòu)中的PKA RII 是形成蛋白二聚化以及與蛋白激酶A 錨定蛋白(AKAPs)相互作用所必需的[17]。SP17 中N 端與之高度相似的氨基酸序列可能具有類似的作用。PEST 序列是一段含有豐富的脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸組成的短序列，長(zhǎng)度大約為10 個(gè)氨基酸殘基，被證明與泛素化降解有關(guān)[18]，而SP17氨基酸鏈上的PEST 序列可能與頂體反應(yīng)中高分子量的Sp17 蛋白被剪切掉C 端的部分序列以及鈣調(diào)素結(jié)合位點(diǎn)而最終呈現(xiàn)出小分子量的蛋白增加現(xiàn)象有關(guān)。

近年來(lái)針對(duì)Sp17的研究發(fā)現(xiàn)，相比于在普通正常組織中表達(dá)量極低甚至不表達(dá)，該基因在一些多發(fā)性骨髓瘤[19]以及卵巢癌細(xì)胞[20]中也具有大量表達(dá)，這一新的發(fā)現(xiàn)也打破了以往人們認(rèn)為的Sp17 只能在雄性個(gè)體中精子不同形成階段發(fā)揮作用的認(rèn)識(shí)。Sp17 基因的這一特點(diǎn)使其具有作為理想靶點(diǎn)的先決條件，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的靶向治療提供了明確的方向[21]。Sp17 在人體中的組織表達(dá)特異性分析表明，通常情況下Sp17 在女性體內(nèi)正常組織中表達(dá)量極低，而在病變的卵巢癌組織中表達(dá)量很高，因此，曹王麗等[22]制備了高特異性抗Sp17的單克隆抗體3C12，成功用于卵巢癌抗腫瘤藥物的研究。而李芳秋等[23]通過(guò)RT-PCR 技術(shù)對(duì)大量腫瘤樣本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SP17的mRNA 在原發(fā)性卵巢癌組織中的檢出率高達(dá)84.5%，而不同來(lái)源的腫瘤組織中Sp17的表達(dá)量差異可能作為判斷卵巢癌組織來(lái)源的重要標(biāo)志[24]。張春華等[25]在針對(duì)不孕癥的研究中發(fā)現(xiàn)這類男性的血清中存在抗Sp17 抗體，并認(rèn)為它可以作為一種輔助診斷的指標(biāo)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)，同時(shí)也說(shuō)明Sp17的自身抗原性使其可能作為避孕疫苗的候選抗原而在避孕過(guò)程中發(fā)揮作用。張巧玉等[26]在實(shí)驗(yàn)中利用重組Sp17 蛋白在小鼠體內(nèi)獲得了高效特異性的表達(dá)，并獲得了具有一定生物活性的表達(dá)產(chǎn)物，這一研究成果為人類避孕藥的開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

2 精子鞭毛蛋白

2.1 理化性質(zhì)

精子鞭毛蛋白1 和精子鞭毛蛋白2 同屬于精子鞭毛蛋白家族，被認(rèn)為與精子鞭毛結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)。Spef1最初是在老鼠的2 號(hào)染色體上某個(gè)含有Cenpb[27]以及Cdc25C[28]基因的區(qū)域內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的。CHAN，et al[29]利用Northern 印記雜交顯示在小鼠體內(nèi)存在不同長(zhǎng)度的Spef1mRNA，克隆得到的兩種Spef1 cDNA 序列，均能編碼長(zhǎng)度為234 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量約為27kDa的蛋白。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Spef1的cDNA 在其3’UTR 區(qū)存在不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，由此說(shuō)明在較長(zhǎng)的cDNA 分子中可能存在著可變的多腺苷酸化位點(diǎn)。此外，其氨基酸序列中還存在多個(gè)潛在的磷酸化以及糖基化位點(diǎn)，并在107-110 號(hào)氨基酸處存在潛在的核定位信號(hào)位點(diǎn)。

基于大量的精子鞭毛蛋白同源蛋白分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其序列的保守性差異可以將這類蛋白區(qū)分為兩種類型，即Spef1 和Spef2，它們之間唯一的區(qū)別就是，Spef2 氨基酸序列中位于羧基末端的40 個(gè)氨基酸殘基在進(jìn)化中極不保守，而且Spef2 主要在脊索動(dòng)物中有表達(dá)。這樣的區(qū)別也暗示著它們?cè)谏矬w內(nèi)可能發(fā)揮不同的作用。雖然科學(xué)家根據(jù)對(duì)豬[30]不同組織中Spef2 基因表達(dá)研究結(jié)果預(yù)測(cè)人體內(nèi)也可能存在兩種Spef2轉(zhuǎn)錄模式，但是目前通過(guò)實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)到1 種Spef2 轉(zhuǎn)錄本[31]。

CH 結(jié)構(gòu)域最早是在鈣調(diào)蛋白中被發(fā)現(xiàn)的，它位于鈣調(diào)蛋白的N 端，長(zhǎng)度大約為100 個(gè)氨基酸殘基，通常情況下除了肌動(dòng)蛋白，還有細(xì)胞骨架蛋白以及信號(hào)蛋白這3 個(gè)主要的蛋白類別中也存在著不同數(shù)量的CH 結(jié)構(gòu)域[32]。在三維結(jié)構(gòu)上，具有球狀褶皺結(jié)構(gòu)的CH 結(jié)構(gòu)域由4 個(gè)主要的螺旋結(jié)構(gòu)組成，其中3 個(gè)形成了1 個(gè)寬松的三重螺旋束結(jié)構(gòu)，彼此之間由loop 結(jié)構(gòu)串聯(lián)[33]。針對(duì)氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，Spef1 與Spef2的N 端均存在1 個(gè)2 型CH 同源結(jié)構(gòu)域(CH2)，這意味著它可能具有結(jié)合F 肌動(dòng)蛋白的能力。而在靠近C 端的位置存在1 個(gè)具有鈣結(jié)合能力的EF-hand 結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)可能參與調(diào)節(jié)Spef2 生物活性。此外，在靠近N 端位置還存在1 個(gè)DUF1042 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的功能目前未知，但是研究發(fā)現(xiàn)在與精子鞭毛相關(guān)的蛋白[34]中均存在這樣的結(jié)構(gòu)域，例如Spata4 蛋白(NP_653245)以及來(lái)自單細(xì)胞生物萊茵衣藻的Cpc1(AAT40991)。值得注意的是，在Cpc1 蛋白[35]中同樣存在EF-hand 結(jié)構(gòu)，科學(xué)家通過(guò)突變Cpc1 基因的研究發(fā)現(xiàn)，它與中央微管的組裝有關(guān)并能影響鞭毛擺動(dòng)頻率。

2.2 組織表達(dá)特異性及生物學(xué)功能

Cdc25C[28]是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白主要在精巢中表達(dá)并參與精巢的某些功能；Cenpb[27]也被認(rèn)為跟精巢的某些生理功能有關(guān)。而Spef1 作為Cenpb 臨近的下游基因，很可能也在精巢的某些功能中扮演著重要角色。研究人員通過(guò)Western blot 以及RT-PCR 對(duì)小鼠不同發(fā)育階段各組織中Spef1 基因mRNA含量的分析發(fā)現(xiàn)，Spef1 基因主要在精巢組織中有大量的表達(dá)[29]。并利用Spef1 抗體通過(guò)免疫熒光的方法對(duì)Spef1 在小鼠體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行定位，結(jié)果顯示Spef1 在小鼠精巢的生精上皮組織中有大量表達(dá)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Spef1 在不同時(shí)期的曲精小管腔內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生離散信號(hào)，但是，最早檢測(cè)到Spef1 信號(hào)是在小鼠精子產(chǎn)生的第九個(gè)階段[36]，且隨著精子逐漸發(fā)育成熟，蛋白信號(hào)不斷增強(qiáng)，推測(cè)老鼠Spef1 可能參與了精子的發(fā)生、形成以及鞭毛結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程。雖然利用免疫技術(shù)在精子鞭毛結(jié)構(gòu)的外層致密纖維以及纖維鞘中均發(fā)現(xiàn)了Spef1 蛋白的存在，但是它與這些結(jié)構(gòu)之間存在的聯(lián)系目前尚不清楚。Spef1 蛋白在自然界中分布比較廣泛，截至目前，Spef1的一些同源基因已經(jīng)在脊索動(dòng)物海鞘Pyrosomella verticilliata[37]以及單細(xì)胞原生動(dòng)物衣藻Chlamydomonas[38]的體內(nèi)被相繼發(fā)現(xiàn)。在某些原生動(dòng)物例如鞭毛蟲或者纖毛蟲[39-41]中也發(fā)現(xiàn)了Spef1 同源蛋白的蹤跡，而且在氨基酸序列上高度保守，這些證據(jù)表明，Spef1 極有可能參與了鞭毛結(jié)構(gòu)的形成或組裝，這種作用可能與它在精子鞭毛的形成過(guò)程中所起的作用是相似的。此外，在哺乳動(dòng)物老鼠、人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了它的同源蛋白。對(duì)Spef1 基因的組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)除了精巢，在其它組織中也檢測(cè)到了微量的Spef1 基因表達(dá)，這可能是由于Spef1 在某些具有鞭毛或者纖毛結(jié)構(gòu)的組織中也起著類似作用的緣故[42]。

SIRONEN，et al[34]的原位雜交結(jié)果顯示Spef2的mRNA 主要在晚期精母細(xì)胞以及圓形精子形成階段表達(dá)，而RT-PCR 結(jié)果表明，Spef2 基因主要在精子發(fā)生的1-7 階段大量表達(dá)，并從第九階段開始表達(dá)信號(hào)逐漸減弱，之后利用酵母雙雜交系統(tǒng)以及免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了Spef2 與蛋白ITF20[43]之間的相互作用關(guān)系。基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Spef2 基因突變會(huì)導(dǎo)致家豬出現(xiàn)短尾精子從而造成精子運(yùn)動(dòng)活力的大幅度減弱[30]，進(jìn)而影響受精過(guò)程。而這些異常的精子會(huì)呈現(xiàn)出鞭毛結(jié)構(gòu)中央微管結(jié)構(gòu)、外圍纖維鞘結(jié)構(gòu)、外部致密纖維結(jié)構(gòu)以及線粒體鞘結(jié)構(gòu)的異常，最嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致精子鞭毛主體結(jié)構(gòu)的部分缺失[44]，這些結(jié)構(gòu)上的缺陷極大的影響了精子的活力以及受精的成功率。然而，除了在精子細(xì)胞，Spef2 也被認(rèn)為可能在那些含有鞭毛、纖毛以及軸絲結(jié)構(gòu)的組織中有大量的表達(dá)，這可能是因?yàn)楸廾洼S絲結(jié)構(gòu)在生物體內(nèi)有著相同的發(fā)育起點(diǎn)。

3 展望

截止目前，除了Sp17 以及Spef1、Spef2 以外還有多種基因被認(rèn)為參與了精子形成或者受精過(guò)程，包括H1fnt、Gopc、Agfg1、Gba2、Crem、MNS1、Spag16、Kif3a 和KLC3 等。然而針對(duì)相關(guān)基因和蛋白的研究主要局限于哺乳動(dòng)物，伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，它們?cè)谏矬w內(nèi)的功能以及作用機(jī)理將被進(jìn)一步揭示，與此相關(guān)的研究也將繼續(xù)進(jìn)行，將極大的豐富對(duì)于動(dòng)物生殖發(fā)育的研究?jī)?nèi)容，并可能為醫(yī)學(xué)診斷以及藥品開發(fā)提供良好的思路和借鑒。