間充質(zhì)干細(xì)胞來源的胞外囊泡在肺纖維化治療中研究進(jìn)展

梁秀萍 黎艷紅 周 雨 胡娣萍 劉 毅

間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是一組具有共同的放射學(xué)、病理學(xué)和臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性肺實(shí)質(zhì)疾病[1]。而肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)以肺泡結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積和肺瘢痕形成為特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)為肺功能受損，肺泡氣體交換受阻，從而導(dǎo)致低氧血癥，呼吸困難，甚至呼吸衰竭及死亡，是許多ILD的共同結(jié)局[2]。多種因素可導(dǎo)致肺纖維化，如自身免疫性疾病、病毒感染、二氧化硅吸入、長期吸煙、輻射、化療、放療、基因改變等[3]。肺纖維化的高發(fā)生率和病死率已成為一個(gè)主要的公共問題[4]。

目前臨床上針對(duì)ILD的治療藥物以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及抗纖維化藥物即吡非尼酮和尼達(dá)尼布為主，但存在費(fèi)用高、部分患者治療效果不佳等情況[1,3]。因此研究安全且性價(jià)比高的ILD治療新方法迫在眉睫。近年來干細(xì)胞治療方面的研究給肺纖維化等很多疾病的治療帶來了希望。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞發(fā)揮治療作用的途徑除了細(xì)胞直接接觸，更重要的是其旁分泌途徑[5]。干細(xì)胞能分泌胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs)，特異性識(shí)別靶細(xì)胞和傳遞信號(hào)，繼而調(diào)控靶細(xì)胞的功能，達(dá)到與干細(xì)胞相應(yīng)的治療效果[6]。目前有多項(xiàng)臨床前研究表明干細(xì)胞來源EVs能有效緩解PF動(dòng)物模型的病理結(jié)局[7, 8]。本文將從間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源EVs治療PF以及相關(guān)的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

一、MSCs及MSC-EVs

MSCs是一種來自中胚層且廣泛存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)的非造血多能干細(xì)胞，具有自我更新和向中胚層組織分化的能力，如分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，且具有抗炎、免疫抑制、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成等功能，亦是目前細(xì)胞治療研究中最常用的一種細(xì)胞類型[5]?，F(xiàn)在MSCs作為一種自身免疫和炎性疾病的免疫抑制治療，已廣泛應(yīng)用于許多疾病的臨床試驗(yàn)，包括移植物抗宿主病、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎臟疾病等[9]。同時(shí)有不少有關(guān)MSCs治療肺纖維化的臨床前研究和臨床試驗(yàn)探索性研究，關(guān)于短期安全性和有效性的研究結(jié)果都提示干細(xì)胞治療的可行性[8, 10]。但是，目前間充質(zhì)干細(xì)胞存在移植后易死亡、移植率低、易堵塞、長期易成瘤等缺點(diǎn)，這讓很多醫(yī)生和患者望而生畏，在很大程度上限制了它的臨床應(yīng)用[11]。而EVs的發(fā)現(xiàn)能讓研究很好地規(guī)避這些缺點(diǎn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源的胞外囊泡(MSC-EVs)根據(jù)其被干細(xì)胞泌出方式及大小不同，主要分為3種類型：①外泌體(exosomes，EXOs)：直徑30～150nm，通過干細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合分泌到細(xì)胞外環(huán)境而產(chǎn)生；②微囊泡/微粒(microvesicles，MVs)：直徑50～1000nm，通過質(zhì)膜向外出芽、分裂以及隨后向細(xì)胞外空間釋放小泡而產(chǎn)生；③凋亡小體：直徑1000～5000nm，是干細(xì)胞凋亡時(shí)釋放的異質(zhì)性囊泡[12]。MSC-EVs是一種天然、高效的運(yùn)輸載體，可以保持與母體細(xì)胞相似的功能特征，具有促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)和一定的增殖再生功能[12,13]。而且作為一種膜結(jié)構(gòu)，MSC-EVs具有免疫原性低、半衰期長、體內(nèi)穩(wěn)定性好、傳遞效率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種比干細(xì)胞治療更安全、更有效的新型非細(xì)胞生物治療方法[9]。

二、MSC-EVs治療肺纖維化的機(jī)制

肺纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，很多機(jī)制尚不明確。目前研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化的發(fā)生主要是因?yàn)橥庠葱曰騼?nèi)源性因素引起內(nèi)皮細(xì)胞和(或)肺泡上皮反復(fù)損傷，激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放各種細(xì)胞因子和生長因子，募集免疫細(xì)胞并浸潤組織，最終激活成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并分泌過多的膠原纖維，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積[14]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前暫無關(guān)于MSC-EVs治療纖維化的臨床研究發(fā)表，但是有部分國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了這方面的基礎(chǔ)研究。目前研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs在肺纖維化模型中具有保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制單核-吞噬細(xì)胞募集分化和炎性細(xì)胞因子釋放，抑制成纖維細(xì)胞增殖分化，減少膠原的生成等作用，繼而改善纖維化模型的纖維化程度，從而達(dá)到治療效果[7,8,15]。

1.保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化：越來越多的研究表明，肺泡上皮細(xì)胞在肺纖維化過程中起著重要作用，其異常的生理病理過程包括增殖、凋亡、細(xì)胞衰老及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，都會(huì)引起或加重肺纖維化[16]。MSC-EVs在這方面的研究也最豐富。Yang等[15]將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes，HUCMSC-EXOs)經(jīng)尾靜脈單次注射給博來霉素誘導(dǎo)的C57/6小鼠肺纖維化模型，第21天處死小鼠發(fā)現(xiàn)HUCMSC-EXOs可顯著降低肺纖維化小鼠的肺系數(shù)(肺濕重/體重×100%)，改善肺組織切片膠原沉積和肺組織病理變化，同時(shí)降低小鼠TGF-β1、p-smad2/3和波形蛋白(vimentin)的表達(dá)，增加E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)。而vimentin和E-cadherin正是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白。該研究還發(fā)現(xiàn)，與造模后第11天給予HUCMSC-EXOs比，第2天給藥治療效果更加明顯。進(jìn)一步的體外研究中，他們將HUCMSC-EXOs與TGF-β1刺激的A549細(xì)胞(肺部上皮樣細(xì)胞)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1促進(jìn)下游smad2/3蛋白磷酸化，使vimentin 下調(diào)，E-cadherin上調(diào)，而這一作用可被HUCMSC-EXOs反轉(zhuǎn)。該研究認(rèn)為，HUCMSC-EXOs可以通過抑制TGF-β1/smad2/3信號(hào)通路激活的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而緩解小鼠肺纖維化程度，且早期給藥效果更加明顯。此外，Xiao等[17]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EXOs(bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes，BMSC-EXOs)經(jīng)尾靜脈給予LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型和LPS刺激的小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-1，發(fā)現(xiàn)BMSC-EXOs 可通過沉默Ikbkb和破壞IKKβ的穩(wěn)定性，抑制NF-κB和hedgehog通路，進(jìn)而下調(diào)vimentin，上調(diào)E-cadherin，從而反轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的EMT過程。而Chen等[18]研究表明,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源微粒(HUCMSC-MVs)傳遞的miR-100通過靶向mTOR增強(qiáng)自噬，抑制博來霉素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型的肺細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和纖維化，同時(shí)在體外研究中減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。以上研究表明MSC-EVs可通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞，進(jìn)而改善肺纖維化。

2.抑制單核-吞噬細(xì)胞細(xì)胞募集分化和炎性細(xì)胞因子釋放：肺組織中的巨噬細(xì)胞有兩種來源，一種為組織定居巨噬細(xì)胞，分布在肺泡和肺間質(zhì)中，另一種是在炎癥等刺激下的被募集到受損肺組織的骨髓來源單核細(xì)胞[19]。骨髓單核細(xì)胞遷移到組織內(nèi)后成為組織巨噬細(xì)胞，其處于休眠的狀態(tài)稱為M0，M0在不同炎性細(xì)胞因子刺激下分化為：①經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞M1，可促炎殺菌，終止損傷修復(fù)過程，防止過度修復(fù)；②選擇性活化巨噬細(xì)胞M2，可抗炎和促進(jìn)組織修復(fù)[20]。目前,大部分研究提示M1和M2可促進(jìn)肺纖維化進(jìn)程，但是個(gè)別研究出現(xiàn)相反的結(jié)果，所以M1和M2與肺纖維化的關(guān)系尚不確定[21]。近年來，在MSC-EVs治療心血管、消化、泌尿和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病時(shí)關(guān)于巨噬細(xì)胞極化的研究中，均發(fā)現(xiàn)MSC-EVs通過抑制M1型細(xì)胞，提高M(jìn)2型細(xì)胞的表達(dá)來達(dá)到治療作用[22]。在肺纖維化中，MSC-EVs如何使調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，又能否通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化達(dá)到治療效果呢？Willis等[23]將新生小鼠暴露于高氧 (75%O2)，誘導(dǎo)支氣管肺發(fā)育不良模型，且在出生后第4天使用HUCMSC-EXOs治療，在出生后第7天返回室內(nèi)空氣。分別在出生后第7、14、42天處理動(dòng)物進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露的小鼠表現(xiàn)出明顯的肺泡簡化、纖維化和肺血管重構(gòu)，而這些表現(xiàn)在HUCMSC-EXOs治療后得到有效改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外，HUCMSC-EXOs可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型，抑制促炎M1狀態(tài)(CCL2、CCL7、IL-6)和增強(qiáng)抗炎M2狀態(tài)(arginase-1、CD206、CCL17)，進(jìn)而得出HUCMSC-EXOs可通過調(diào)節(jié)肺巨噬細(xì)胞表型緩解高氧誘導(dǎo)的支氣管肺發(fā)育不良模型，改善肺功能，減少纖維化和肺血管重塑，以及改善肺動(dòng)脈高壓的結(jié)論。同樣的，Mansouri等[8]研究發(fā)現(xiàn)，給博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型注射BMSC-EXOs可以減少經(jīng)典促炎單核細(xì)胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR2+Ly6chi)的數(shù)量，增加非經(jīng)典單核細(xì)胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR2-Ly6clo)和肺泡巨噬細(xì)胞(CD45+CD11b-CD11c+CD64+)的水平從而減少肺泡變形，降低膠原水平，以及改善Ashcroft評(píng)分。然而這種巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)和肺纖維化的緩解是否同樣能在其他肺纖維化模型中達(dá)到，還有待于進(jìn)一步研究。

3.制成纖維細(xì)胞增殖分化，減少膠原的生成：肺成纖維細(xì)胞在TGF-β等促纖維化因子的刺激下活化并分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量膠原并沉積在肺組織，直接導(dǎo)致了肺纖維化，是肺纖維化的最終階段[24]。目前，Shentu等[25]將MSC-EVs分別作用于TGF-β1刺激的正常肺成纖維細(xì)胞和特發(fā)性肺纖維化患者的肺成纖維細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，與未使用MSC-EVs的對(duì)照組比較，MSC-EVs組的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N) 、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)均顯著下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs中的miR-630可以阻斷正常肺成纖維細(xì)胞和IPF成纖維細(xì)胞中TGF-β1對(duì)N-鈣黏蛋白2(N-cadherin，CDH2)的誘導(dǎo)。Wan等[7]在特發(fā)性肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs可通過miR-29b-3p下調(diào)肺成纖維細(xì)胞中卷曲蛋白6(frizzled 6，F(xiàn)ZD6)的表達(dá)，從而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和分化，同時(shí)降低α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)。同時(shí)，在皮膚纖維化的研究中，Hu等[26]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，HUMSC-EXOs能夠通過抑制成纖維細(xì)胞的經(jīng)典信號(hào)通路以及TGF-β1/smad 2/3信號(hào)通路來抑制真皮成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，這為肺纖維化的研究提供了思路。

三、microRNAs的作用

MSC-EVs通過攜帶的多種物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸(包括microRNAs，mRNA和DNA等)等來實(shí)現(xiàn)其生物效應(yīng)[12]。其中，microRNAs是一類系統(tǒng)發(fā)育上保守的非編碼RNA，其長度為19～22個(gè)堿基的單鏈核糖核酸，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[27]。MSC-EVs可以使靶細(xì)胞通過內(nèi)吞或融合將microRNAs和其他生物活性分子轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而與鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞通信。MSC-EVs能通過轉(zhuǎn)移不同或相同的microRNAs治療疾病，這在腎臟、肝臟、心臟、腦等疾病的研究中均已被證明[28]。在肺纖維化的研究中也發(fā)現(xiàn)EVs中microRNAs的作用。 Xiao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC-EXOs通過miR-23a-3p和miR-182-5p協(xié)作來調(diào)控NF-κB和hedgehog通路，進(jìn)而反轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的EMT過程，緩解肺纖維化的發(fā)展。同樣的，Chen等[18]研究表明，HUCMSC-MVs是通過傳遞miR-100部分改善ALI模型大鼠的肺細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和纖維化。Shentu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs通過傳遞miR-630來阻止成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞的分化。Sun等[29]將經(jīng)血中子宮內(nèi)膜干細(xì)胞來源的EXOs分別作用于博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型和TGF-β1處理的肺泡上皮細(xì)胞MLE-12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EXOs通過將miRNA-Let-7轉(zhuǎn)運(yùn)到肺泡上皮細(xì)胞中，進(jìn)而下調(diào)ROS的水平和LOX1的表達(dá)、改善線粒體DNA的損傷以及抑制炎癥體NLRP3的激活，從而緩解肺纖維化。

四、展 望

MSC-EVs具有促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)和一定的增殖再生功能，可以通過轉(zhuǎn)移microRNA保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制單核-吞噬細(xì)胞募集分化和炎性細(xì)胞因子釋放，以及抑制成纖維細(xì)胞增殖分化，減少膠原的生成等，改善各種肺疾病模型的纖維化程度，具有很好的應(yīng)用前景。然而還有問題需要進(jìn)一步解決，MSC-EVs制備和保存等技術(shù)并不成熟，這在很大程度上限制了MSC-EVs的應(yīng)用。同時(shí)，MSC-EVs的給藥方式、頻次、劑量等在各研究中均有不同，還需要大量的臨床前研究和大規(guī)模的臨床研究來統(tǒng)一確定。MSC-EVs在肺纖維化中的作用機(jī)制仍處于探索階段，尤其是MSC-EVs可能會(huì)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，這是否會(huì)促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)展，需要筆者更加深入的研究。筆者研究距使用MSC-EVs進(jìn)行安全、有效、規(guī)范的肺纖維化治療還有很大一段的距離，需要開展進(jìn)一步的研究予以證實(shí)。