lncRNA AK126393通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增值與凋亡

莊 彪 閔志均 倪 熊 王廷峰 吳德俊 崔 鵬

結(jié)腸直腸癌(carcinoma of colon and rectum，CRC)是世界上第三大常見(jiàn)的癌癥與第四大死亡原因的胃腸道惡性腫瘤，其具有高復(fù)發(fā)率和高致死率的特點(diǎn)[1～5]。研究表明不良飲食習(xí)慣、腸道炎癥、腸息肉、遺傳、年齡等增加患癌風(fēng)險(xiǎn)，并且年輕患者侵襲更強(qiáng)[6,7]。如何探索結(jié)直腸癌新的作用機(jī)制開(kāi)發(fā)新的療法成為研究的新方向。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種超過(guò)200個(gè)核苷酸且不翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，且被認(rèn)為沒(méi)有生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄“噪聲”[8,9]。研究表明，在腫瘤中其參與增殖、凋亡、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[10,11]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA-AK126393與結(jié)直腸癌自噬相關(guān)，并在結(jié)直腸癌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)鑒定，進(jìn)一步干預(yù)其表達(dá)探討其在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix(MQ10301S，蘇州莫納生物科)；PrimeScript RT Master Mix (RR036A，日本TaKaRa公司)；RNAiso Plus(9109，日本TaKaRa公司)；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit(70-AT101-100，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；Cell cycle staining kit(70-CCS012，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；Lipofectamine TM 2000(11668030，美國(guó)Invitrogen公司)；Fetal Bovine Serum(10099141，美國(guó)Gibco公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(31870082，美國(guó)Gibco公司)；Bcl2(cst- 3498)、Bax(cst- 2774)、PI3K(cst- 4249)、P-PI3K(cst- 13857)、Akt(cst- 9272)、P-Akt(cst- 4060)、LC3(cst- 12741)和GAPDH(cst-5174)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；質(zhì)粒構(gòu)建、引物合成、二抗等常用生化試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116、SW480、SW620和正常人結(jié)腸組織細(xì)胞CCD-18CO購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司;槍頭、細(xì)胞培養(yǎng)板等常用耗材購(gòu)自無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人結(jié)腸癌細(xì)胞系和正常人結(jié)腸組織細(xì)胞培養(yǎng)均用10%FBS+1%雙抗的RPMI164完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，靜置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)80%后進(jìn)行消化傳代接種，按105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種與6孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。AK126393片段全長(zhǎng)合成并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒委托工生物工程(上海)股份有限公司完成，使用Lipofectamine TM 2000將pcDNA3.1-AK126393質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后更換正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)qRT-PCR：經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染處理后細(xì)胞，根據(jù)RNAiso Plus說(shuō)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并應(yīng)用RT Master Mix適合對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃ 5min、95℃ 10s、60℃ 30s的40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行qPCR，靶基因引物序列如下：AK126393-上游引物：5′-TAAAGCTCCCGATGCCAGAC-3′，AK126393-下游引物：5′-GCCAACCTGATGTCCTTGGA-3′；GAPDH-上游引物：5′-GAGGCTGGGAACCTTAAGGT-3′，GAPDH-下游引物:5′-AGGGCCGCTGGTCAGAA-GTT-3′。靶基因的表達(dá)水平用△Ct歸一化，相對(duì)倍數(shù)變化用2-△△Ct。(3)CCK-8檢測(cè)：各組細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在接種后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96h后進(jìn)行增值檢測(cè)。每孔加入10μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1h，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本在450nm出的吸光度。(4)流式細(xì)胞術(shù)：將各組細(xì)胞用胰酶消化并收集各組細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-FITC/PI apoptosis kit和Cell cycle staining kit試劑盒廠商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞染色處理后用Cytoflex流式細(xì)胞儀檢測(cè)個(gè)組細(xì)胞凋亡和周期變化。(5)Western blot法：將培養(yǎng)板中的各組細(xì)胞加入蛋白裂解液及PMSF進(jìn)行提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20μl蛋白樣品加載到10%的分離膠上，并通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)。然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入封閉液37℃封閉1h；將膜與LC3、Bax、Bcl2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH抗體4℃過(guò)夜孵育。TBST反復(fù)洗膜3次后，將膜與辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗孵育，室溫輕搖1h，洗膜后，入顯色液顯色并拍攝分析。

結(jié) 果

1.lncRNA AK126393在正常人結(jié)腸組織細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞系的表達(dá)：與正常人結(jié)腸組織細(xì)胞系(CCD-18CO)比較，lncRNA AK126393在結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、SW620、SW480)中異常低表達(dá)(P<0.05)，其中SW480細(xì)胞中表達(dá)量最低(P=0.000，圖1)。

圖1 AK126393在正常人結(jié)腸組織細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞系的表達(dá)與CCD-18CO細(xì)胞比較，*P<0.05，** P<0.01，***P=0.000

2.在SW480細(xì)胞中AK126393過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率：在轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)?？蛰d體和AK126393過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后SW480細(xì)胞中的AK126393的相對(duì)表達(dá)量為1.05±0.05和2.56±0.21(P<0.01，圖2)。

圖2 AK126393在SW480細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平與NC組細(xì)胞比較，*P<0.01

3.過(guò)表達(dá)AK12639對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響：CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示， AK126393過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降(P<0.05，圖3A)，在流式周期檢測(cè)試驗(yàn)中，觀察到一致的數(shù)據(jù)(圖3B)。

圖3 AK126393過(guò)表達(dá)抑制SW480細(xì)胞增殖A.轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96h后，通過(guò)CCK8測(cè)定法測(cè)定SW480細(xì)胞的細(xì)胞活力；B.轉(zhuǎn)染24h后，通過(guò)流式細(xì)胞周期法測(cè)量SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期。與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

4.AK126393過(guò)表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，AK126393過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡比例顯著增加(圖4A)；Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示凋亡蛋白Bax表達(dá)增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬蛋白LC3-Ⅰ降低，LC3-Ⅱ增高(圖4B)。

圖4 AK126393過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞凋亡和自噬的影響A.流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡；B.Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax和LC3蛋白表達(dá)。與NC組細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

5.AK126393過(guò)表達(dá)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路：Western blot法檢測(cè)結(jié)果如圖5顯示，與NC組相比較，AK126393過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中PI3K和Akt的磷酸化水平顯著降低，而總PI3K和總Akt的表達(dá)無(wú)變化。

圖5 AK126393過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞中PI3K/Akt通路的作用與NC組細(xì)胞比較，*P<0.05

討 論

研究表明，lncRNA的表達(dá)異常影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的的各個(gè)方面，如生存，增殖、遷移和基因組穩(wěn)定性等，并且多種lncRNA的表達(dá)異表達(dá)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和預(yù)后不良有關(guān)[12～14]。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，越來(lái)越多的lncRNA的異常表達(dá)與不同類(lèi)型的癌癥有關(guān)得到證實(shí)[15]。AK126393是高通量篩發(fā)現(xiàn)的一種新型的與癌癥相關(guān)的lncRNA，位于染色體10q26，在結(jié)腸癌組織中異常低表達(dá)，被認(rèn)為是具有抑制腫瘤作用的分子[16]，而其用機(jī)制不清楚。因此，筆者在細(xì)胞系中檢測(cè)了AK126393表達(dá)，結(jié)果與先前的文獻(xiàn)分析相符。為了進(jìn)一步證實(shí)，筆者通過(guò)過(guò)表達(dá)SW480細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞增值收到抑制、凋亡增加并發(fā)生了自噬現(xiàn)象。lncRNA在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用復(fù)雜，通常與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和自噬等生物學(xué)行為有關(guān)。例如，lncRNA TUG1調(diào)控miRNA-145促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，lncRNA HULC促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖與提高肺癌細(xì)胞自噬水平,且與自噬相關(guān)蛋白ATG7相關(guān)[17,18]。

PI3K/Akt廣泛分布在細(xì)胞中，許多反定義RNA影響細(xì)胞表型的調(diào)控都是通過(guò)PI3K/Akt途徑實(shí)現(xiàn)的，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增、分化、凋亡和代行等[19～21]。本研究中筆者提出AK126393抑制PI3K/Akt新思路，為明確AK126393在結(jié)腸癌細(xì)胞系調(diào)控的作用提供了支持。PI3K是具有催化活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，在多種人類(lèi)癌癥中通常由于基因擴(kuò)增和體細(xì)胞點(diǎn)突變而失調(diào)[22]。Akt是PI3K下游的靶向調(diào)節(jié)分子，在維持細(xì)胞活和凋亡中起到重要功能蛋白，因?yàn)樗せ疃喾N酶和轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[23]。研究表明，在腫瘤增殖、凋亡、侵襲、耐藥的方面p-Akt蛋白起著重要的作用，是重要促進(jìn)因子[24,25];在抗癌藥物研發(fā)方向Akt的活化抑制是重要研究途徑之一[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)AK126393在SW480細(xì)胞中表達(dá)能抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡并引起細(xì)胞自噬；并且發(fā)現(xiàn)其PI3K和Akt的磷酸蛋白化水平顯著降低，PI3K和Akt總蛋白無(wú)明顯變化。從而證明AK126393可以通過(guò)PI3K/Akt通路的激活抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)抗癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AK126393具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡以及引起細(xì)胞自噬的作用。此外證實(shí)，lncRNA AK126393通過(guò)抑制PI3K/Akt途徑激活來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。因此，lncRNA AK126393為今后結(jié)腸癌的診治提供新的潛在靶標(biāo)。