單細(xì)胞RNA 測(cè)序在賢移植排斥領(lǐng)域的應(yīng)用及進(jìn)展

熊旨雷，王振，付迎欣（天津市第一中心醫(yī)院賢移植科，天津 300192）

在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)里，因?yàn)槊庖咭种苿┑难邪l(fā)以及免疫抑制方案的優(yōu)化，臨床器官移植無(wú)疑已取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展［1］。自從20 世紀(jì)80 年代鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素及20 世紀(jì)90 年代新的小分子和生物制劑被成功引進(jìn)移植免疫抑制領(lǐng)域以來(lái)，賢移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生率從40%下降到了10%～15%［2］，然而慢性排斥反應(yīng)導(dǎo)致的移植物遠(yuǎn)期存活率下降仍是一個(gè)亟待解決的難點(diǎn)［3］。相關(guān)研究表明，排斥反應(yīng)的早期診斷和早期干預(yù)可以改善移植賢的預(yù)后［4］。

單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術(shù)自2009 年發(fā)表以來(lái)得到了快速的發(fā)展［5］，不同于以往的測(cè)序技術(shù)，它能記錄一個(gè)復(fù)雜有機(jī)體或組織中每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀況，為研究細(xì)胞間的異質(zhì)性、描述不同細(xì)胞間的狀態(tài)及發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類(lèi)型提供了新的思路［6］。這種方法可以用于了解移植物中正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)，從而可能為排斥反應(yīng)的診斷、治療或預(yù)后提供新的思路和見(jiàn)解［1］。本篇綜述結(jié)合近年來(lái)發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，系統(tǒng)的闡述scRNA-seq 的技術(shù)發(fā)展以及其在移植賢排斥反應(yīng)方面的應(yīng)用及進(jìn)展。

1 單細(xì)胞RNA 測(cè)序技術(shù)的起源和發(fā)展

人體不同類(lèi)型的細(xì)胞雖然具有相同的遺傳物質(zhì)，但它們的大小、形態(tài)、表型、細(xì)胞內(nèi)容物、代謝活動(dòng)以及功能卻不盡相同。這種細(xì)胞異質(zhì)性很大程度上是由外部因素引起的，這些因素精確地調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的表達(dá)和隨后細(xì)胞的活化、增殖、分化，從而產(chǎn)生不同類(lèi)型和不同功能狀態(tài)的細(xì)胞［7］。在正常情況下，不同細(xì)胞發(fā)揮各自作用一起維持器官功能的穩(wěn)定，往往其中一種或多種細(xì)胞的變化可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此，在單細(xì)胞水平上對(duì)處于疾病狀態(tài)的組織或器官進(jìn)行全面的評(píng)估，可以為診斷、治療和預(yù)后等方面提供有價(jià)值的信息［1］。

流式細(xì)胞術(shù)、原位雜交和免疫組織化學(xué)等傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法可以在細(xì)胞水平上提供部分信息，且這些方法也大大提升了我們對(duì)各種疾病發(fā)病機(jī)制的理解。然而，這些方法一方面只能同時(shí)獲取有限的基因表達(dá)信息，另一方面，雖然微陣列和二代測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)獲取數(shù)千個(gè)基因表達(dá)的信息，但僅限于集合細(xì)胞的樣本，從而忽略了樣本中單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性。因此，這些方法在提供關(guān)于單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄信息方面都具有根本的局限性。

自Tang 等［5］在2009 年發(fā)表了第1 篇scRNAseq 論文以來(lái)，該項(xiàng)技術(shù)得到了不斷發(fā)展，基于單個(gè)細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜分析和表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)功能描述已經(jīng)成為新的研究方法［8-9］，這一強(qiáng)大的技術(shù)已迅速被廣泛用于神經(jīng)科學(xué)、腫瘤和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的研究［10-12］。直至最近幾年，該方法才被用于移植免疫學(xué)的研究。

所有的scRNA-seq 技術(shù)都有如下幾個(gè)共同的步驟：?jiǎn)渭?xì)胞分離、細(xì)胞裂解和RNA 捕獲、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、文庫(kù)生成、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析［13］。 近年來(lái)，從單細(xì)胞懸液的制備、RNA 的擴(kuò)增到復(fù)雜的cDNA文庫(kù)的生成都獲得了多項(xiàng)技術(shù)改進(jìn)［14-17］。檢測(cè)通量的增加提高了scRNA-seq 的效率，但同時(shí)也增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性。幸運(yùn)的是，越來(lái)越多的利用R、Python 和 Matlab 等編程語(yǔ)言設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)和圖形軟件包可以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析過(guò)程，使大量的測(cè)序數(shù)據(jù)可視化，便于研究者分析［18］。

2 移植腎的排斥反應(yīng)及傳統(tǒng)基因測(cè)序

賢移植是終末期賢臟疾病或嚴(yán)重慢性賢臟疾病患者的首選治療方法，與透析相比，它提高了患者的生活質(zhì)量，具有更好的生存優(yōu)勢(shì)。根據(jù)組織病理學(xué)和免疫學(xué)特征，賢移植排斥反應(yīng)可大致分為超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)，除了以上典型類(lèi)型之外還可表現(xiàn)為亞臨床排斥反應(yīng)、細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)同時(shí)存在的混合性排斥反應(yīng)、以及急性排斥反應(yīng)合并慢性排斥反應(yīng)等［19］。目前，臨床上診斷排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)為移植賢的穿刺活檢，用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、間接免疫熒光以及有限的抗體對(duì)活檢組織進(jìn)行染色分析，然而，近幾十年來(lái)的病理分析技術(shù)的進(jìn)展十分有限，病理診斷結(jié)果也并非完全準(zhǔn)確［20-21］。

傳統(tǒng)的基因測(cè)序已被多項(xiàng)研究用來(lái)探究移植器官功能障礙或程序性活檢組織中基因表達(dá)的模式［22-25］，通過(guò)比較某些同種異體移植病理中差異表達(dá)的基因來(lái)用于病理診斷，如急性細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）［26-29］。當(dāng)然，這些大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析幫助我們更好地理解復(fù)雜的移植活檢病理的同時(shí)也幫助臨床做出更加準(zhǔn)確的診斷。AMR 是遠(yuǎn)期移植賢丟失最常見(jiàn)的主要原因［30］，且病理科醫(yī)生對(duì)于急性賢小球炎等關(guān)鍵組織學(xué)病理改變的診斷存在偏差［31］。研究數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄組分析比傳統(tǒng)組織病理學(xué)診斷更好地預(yù)測(cè)了與AMR 診斷相關(guān)的不良結(jié)局，轉(zhuǎn)錄組分析的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）和陰性預(yù)測(cè)值（NPV）分別為50%和94%［29］。利用整個(gè)組織樣本提取RNA 并使用微陣列技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，已被用來(lái)臨床診斷移植賢的排斥反應(yīng)和纖維化［23，32］。同理，有研究使用外周血樣本基因測(cè)序的方法來(lái)預(yù)測(cè)或診斷移植賢的排斥反應(yīng)，Salomon團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用微陣列（基因芯片）技術(shù)，使外周血基因表達(dá)譜可作為一種微創(chuàng)手段，在急性移植賢功能障礙的背景下準(zhǔn)確預(yù)測(cè)排斥反應(yīng)［33］。Roedder 等［34］利用賢移植急性排斥反應(yīng)評(píng)估研究中的大隊(duì)列，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定了一組預(yù)先確定的43 個(gè)基因的表達(dá)量，最終得到一個(gè)17-基因面板組（稱為kSORT）能夠在活檢發(fā)現(xiàn)前3 個(gè)月預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)，但該方法不能區(qū)分T 細(xì)胞介導(dǎo)和抗體介導(dǎo)的排斥。然而，上述所有這些方法都只是測(cè)量了樣本中的平均基因表達(dá)量，而忽略了細(xì)胞間表達(dá)的差異性，大量轉(zhuǎn)錄組分析可能錯(cuò)過(guò)或低估差異表達(dá)的基因，而這些低表達(dá)水平的基因可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［18］。

3 單細(xì)胞RNA 測(cè)序在腎移植排斥領(lǐng)域的應(yīng)用及進(jìn)展

近年來(lái)，因scRNA-seq 技術(shù)對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析優(yōu)勢(shì)，使得該方法逐漸被應(yīng)用于移植免疫學(xué)的研究。scRNA-seq 提供單個(gè)細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)可視化處理，能更加直觀準(zhǔn)確的了解細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，如疾病進(jìn)展、細(xì)胞狀態(tài)的改變、細(xì)胞分化等。

目前，在賢移植領(lǐng)域，已發(fā)表的scRNA-seq 數(shù)據(jù)十分有限。Wu 等［35］發(fā)表了第1 篇關(guān)于移植賢混合排斥反應(yīng)scRNA-seq 數(shù)據(jù)的文章，該研究本對(duì)1 例穿刺活檢時(shí)所取的16 G 有核細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，使用InDrops 進(jìn)行RNA 擴(kuò)增和文庫(kù)生成，每個(gè)細(xì)胞的測(cè)序深度為50 000 個(gè)單位。共有4 487 個(gè)細(xì)胞通過(guò)了質(zhì)量過(guò)濾器，平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到來(lái)自827 個(gè)不同基因的1 481 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，利用T 分布和隨機(jī)近鄰嵌入（tSNE）對(duì)16 個(gè)細(xì)胞簇進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析，包括3 種管狀細(xì)胞類(lèi)型、3 種白細(xì)胞群、4 種淋巴細(xì)胞類(lèi)型、3 種基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型、內(nèi)皮細(xì)胞類(lèi)型和循環(huán)細(xì)胞，這個(gè)數(shù)據(jù)集包含了所有的免疫細(xì)胞群，以及除了賢小球細(xì)胞的大多數(shù)供賢細(xì)胞類(lèi)型。該研究得出了幾個(gè)有趣的結(jié)論，首先，通過(guò)不同類(lèi)型細(xì)胞（FCN1 陽(yáng)性細(xì)胞和CD16 陽(yáng)性細(xì)胞）間的差異基因表達(dá)鑒定出兩種不同的單核細(xì)胞簇，并通過(guò)混合排斥組織樣本的免疫組化染色得到了證實(shí)，正常賢臟染色稀疏或缺失，AMR 活檢組織染色中等。其次，亞聚類(lèi)分析定義了以下3 種不同的內(nèi)皮細(xì)胞類(lèi)型：靜息型、血管生成型和活化型。本文還證實(shí)了內(nèi)皮細(xì)胞在AMR 中的重要性。從微陣列研究中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)與AMR 相關(guān)的高表達(dá)基因在內(nèi)皮細(xì)胞中唯一表達(dá)，然而，在微陣列研究中被描述為內(nèi)皮相關(guān)的基因大多在這個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的非內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，也就是說(shuō)，既往的研究只是根據(jù)體外對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)的研究，推測(cè)微陣列研究中表達(dá)的基因來(lái)自于內(nèi)皮細(xì)胞［36-37］。這突出了基于微陣列的方法在移植物病理研究中的一個(gè)主要局限性。當(dāng)然，這篇文章的局限性是在單一的移植賢活檢的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這些發(fā)現(xiàn)仍有待其他活檢和其他研究來(lái)證實(shí)。

近來(lái)，Liu 等［38］利用10×Genomics 技術(shù)測(cè)得2 例經(jīng)傳統(tǒng)病理證實(shí)的慢性移植賢排斥反應(yīng)（chronic kidney transplant rejection，CKTR）組織的scRNAseq 數(shù)據(jù)，并與GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中3 個(gè)健康成人賢臟的scRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行比較研究。通過(guò)使用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析確定了15 種不同的細(xì)胞類(lèi)型，包括主要免疫細(xì)胞、賢細(xì)胞和少數(shù)幾種基質(zhì)細(xì)胞。并通過(guò)進(jìn)一步比較各細(xì)胞亞群信號(hào)通路的獨(dú)特特征，發(fā)現(xiàn)了與CKTR 不同功能相關(guān)的細(xì)胞亞型。對(duì)CKTR 生物學(xué)的研究提供了更深入的見(jiàn)解，將有助于CKTR 的診斷和治療的研究。Malone 等［39］利用外顯子序列中的單核苷酸變異體（single nucleotide variants，SNVs）的DNA 測(cè)序結(jié)合scRNA-seq 對(duì)5 個(gè)移植賢穿刺標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序研究，探究在AMR 及非排斥反應(yīng)的賢穿標(biāo)本中供/受體來(lái)源的白細(xì)胞的持久性和轉(zhuǎn)錄特性。Dangi 等［40］在小鼠賢移植模型的基礎(chǔ)上，利用scRNA-seq 分析出高表達(dá)Alx 的骨髓細(xì)胞可促進(jìn)供體特異性T 細(xì)胞的增殖和分化，并通過(guò)組織學(xué)證實(shí)與移植賢早期炎癥增強(qiáng)相關(guān)，為賢移植排斥反應(yīng)的治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。

盡管傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)提升了我們對(duì)排斥反應(yīng)的研究深度和理解力，但這些方法僅僅只描述了活檢樣本中表達(dá)基因的“平均值”，那些在排斥反應(yīng)中必然發(fā)生的細(xì)微病理差異可能無(wú)法被分辨，例如，AMR 的發(fā)生可伴或者不伴有C4d 沉積、存在DSA的情況下并不一定會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)等臨床現(xiàn)象需要細(xì)微的分子和細(xì)胞差異來(lái)解釋。因?yàn)榛顧z樣本包含了從免疫細(xì)胞到賢細(xì)胞的多種細(xì)胞類(lèi)型，傳統(tǒng)的測(cè)序方法也同時(shí)缺乏分辨既往忽略的在排斥反應(yīng)中起作用的細(xì)胞類(lèi)型甚至是新的細(xì)胞類(lèi)型的能力［21］。而scRNA-seq 能從單細(xì)胞水平獲得組織病理的轉(zhuǎn)錄信息，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)測(cè)序的不足。

4 單細(xì)胞RNA 測(cè)序在腎移植排斥反應(yīng)領(lǐng)域現(xiàn)存挑戰(zhàn)及潛在應(yīng)用價(jià)值

scRNA-seq 雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但其同時(shí)存在諸多技術(shù)限制。由于單個(gè)細(xì)胞含有極少量的RNA，在需要足夠量的樣本細(xì)胞的同時(shí)，生物和技術(shù)干擾在這種高度敏感的技術(shù)中是很難避免的［1］。此外，由于只有5%～50%的mRNA 可以被逆轉(zhuǎn)錄，通過(guò)該技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)只能代表單個(gè)細(xì)胞的部分生物學(xué)過(guò)程［41］。制備單細(xì)胞懸液的過(guò)程對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響至關(guān)重要，而實(shí)體器官單細(xì)胞懸液的制備是一大挑戰(zhàn)，在組織加工過(guò)程中溫度偏高時(shí)容易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)基因［42］，而這些轉(zhuǎn)錄信息不是被檢查細(xì)胞固有的，盡管這些數(shù)據(jù)可以通過(guò)生物信息學(xué)分析小心地去除，但在數(shù)據(jù)分析時(shí)也應(yīng)保持警惕，數(shù)據(jù)分析方法目前仍需要進(jìn)一步優(yōu)化和發(fā)展。最后，盡管scRNA-seq目前測(cè)序成本已經(jīng)大幅下降，但費(fèi)用仍然昂貴。

5 展 望

應(yīng)用scRNA-seq 對(duì)移植賢病理的單細(xì)胞分析有可能大大提高我們對(duì)導(dǎo)致排斥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制的理解，特別是解釋AMR 的細(xì)微病理變化以及不同患者對(duì)抗排斥治療反應(yīng)的巨大差異。scRNA-seq 將有助于更好地了解排斥反應(yīng)中相關(guān)免疫細(xì)胞和驅(qū)動(dòng)同種免疫反應(yīng)的途徑。scRNA-seq 同時(shí)具備發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物的潛力（賢穿標(biāo)本、血液、尿液等），同時(shí)，scRNA-seq 可以識(shí)別同種異體移植的病理特異性細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)記物，有望幫助臨床病理區(qū)分排斥反應(yīng)類(lèi)型［18］。此外，新的免疫細(xì)胞治療靶點(diǎn)可能會(huì)增加我們目前有限的排斥反應(yīng)治療的手段。