豬腸道冠狀病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

韓 笑，王亞楠，姜金慶，范國英，李任峰，王自良

(河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

豬腸道冠狀病毒(swine enteric coronavirus，SECoV)屬于SECoV屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒表面有棒狀突起，形似“日冕”或皇冠狀，大小為70～200 nm[1]。SECoV基因組含有5’端的帽子結(jié)構(gòu)和3’端的Poly(A)結(jié)構(gòu)，編碼四種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白(Spike, S)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N)、膜蛋白(Membrane, M)、包膜蛋白(Envelope, E)[2-5]。由于其RNA具有較高的重組頻率，導(dǎo)致病毒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易變異。目前已知的SECoV主要包括豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastrogenteritis virus，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)以及豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)[6-8]。

近年來，SECoV的流行與進(jìn)化越來越復(fù)雜，毒株間和毒株內(nèi)重組現(xiàn)象加劇，防控形勢依然嚴(yán)峻[9]。本文就目前SECoV的核酸和免疫學(xué)檢測方法進(jìn)行綜述，旨在為SECoV的防控提供參考依據(jù)。

1 核酸檢測技術(shù)

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是一種通過體外擴(kuò)增病原特定DNA序列從而對(duì)疾病進(jìn)行診斷的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)誕生于1985年，經(jīng)過不斷改進(jìn)已衍生出多種體外擴(kuò)增方法。Ding等[10]基于TGEV、PEDV和PDCoV的N基因、豬A型輪狀病毒(porcine rotavirus A，PRoV-A)VP7基因以及豬庫布病毒(porcine kobuvirus，PKV)和豬薩博病毒(porcine sapovirus，PSaV)的多聚蛋白基因建立了多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測方法，該方法能同時(shí)檢測TGEV、PEDV、PDCoV、PRoV、PKV和PSaV六種豬腸道病毒，與豬的其他病原之間無交叉反應(yīng)。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)的出現(xiàn)解決了普通PCR技術(shù)存在的難以定量、變異系數(shù)較大等問題。Pan等[11]針對(duì)PEDV、豬環(huán)曲病毒(porcine torovirus，PToV)和SADS-CoV的ORF1a區(qū)域以及PDCoV的ORF1b區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan熒光探針，建立了能夠同時(shí)檢測PEDV、PDCoV、SADS-CoV三種豬冠狀病毒和PToV的RT-qPCR方法，該方法的靈敏度可以達(dá)到100拷貝/μl。Ma等[12]根據(jù)冠狀病毒基因組M基因中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR技術(shù)，可用于SADS-CoV的檢測和流行病學(xué)調(diào)查，其靈敏度高于基于探針的RT-qPCR和基于凝膠的常規(guī)RT-PCR方法。雙啟動(dòng)子寡核苷酸(double promoter oligonucleotide, DPO)引物比常規(guī)引物特異性更強(qiáng)，可以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化以及引物與模板的錯(cuò)配機(jī)率。Jia等[13]研制的基于DPO的實(shí)時(shí)RT-qPCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV進(jìn)行特異性檢測。

近年來，納米PCR作為一種新型診斷技術(shù)得到了快速發(fā)展。Zhu等[14]根據(jù)PEDV和TGEV的N基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立了能夠同時(shí)檢測PEDV和TGEV的雙重納米PCR檢測技術(shù)，其檢測限分別達(dá)到7.6×101和8.5×101拷貝/μl，靈敏度為普通RT-PCR的10倍。Luo等[15]建立了一種基于功能化磁珠富集和特異性納米擴(kuò)增技術(shù)的超靈敏納米DNA探針PCR檢測方法，其靈敏度可以達(dá)到25個(gè)拷貝/克樣品。可用于PEDV和TGEV的雙重檢測。以上PCR技術(shù)為SECoV的檢測提供了有力工具，大大提升了豬場SECoV的防控效率。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2000年，日本學(xué)者Notomi開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[16]。其基本原理是利用具有較強(qiáng)鏈置換活性的Bst DNA聚合酶和特殊設(shè)計(jì)的4條或6條引物，在60～65℃恒溫下快速擴(kuò)增目的基因。Mohamed等[17]開發(fā)了一種低成本、快速、半定量的3D打印微流體RT-LAMP芯片檢測系統(tǒng)，可同時(shí)檢測PEDV、PDCoV和TGEV 3種冠狀病毒，整個(gè)檢測過程可以在30min內(nèi)快速完成，檢測結(jié)果與qRT-PCR具有很好的一致性。針對(duì)新型的豬腹瀉冠狀病毒SADS-CoV，Wang等[18]根據(jù)其病毒N基因的保守序列，建立了準(zhǔn)確靈敏的實(shí)時(shí)RT-LAMP方法，與其他病原無交叉反應(yīng)，臨床樣本檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)RT-PCR方法一致。LAMP檢測技術(shù)具有快速、簡單、靈敏、高通量、精度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前臨床診斷的熱點(diǎn)技術(shù)之一。

1.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)是一種新型的DNA擴(kuò)增技術(shù)，利用重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶三種酶的共同作用下，在37℃甚至常溫下快速擴(kuò)增目的基因，與常規(guī)PCR相比具有更高的靈敏性，且擴(kuò)增過程不需要變換溫度。Li等[19]根據(jù)PEDV和PDCoV的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物成功建立了針對(duì)PEDV和PDCoV雙重RT-RPA檢測方法，靈敏度為100個(gè)拷貝/μl。Wang等[20]針對(duì)TGEV的S基因設(shè)計(jì)特異性引物，開發(fā)了快速檢測TGEV的RT-RPA技術(shù)，與其他病原體無交叉反應(yīng)。Gao等[21]將RPA技術(shù)與側(cè)向流免疫層析技術(shù)(later flow dipstick,LFD)相結(jié)合，建立了LFD-RPA快速檢測技術(shù)，能夠在20 min內(nèi)檢測到PDCoV病毒，其靈敏度是傳統(tǒng)PCR的10倍。靈敏度高、特異性強(qiáng)的LFD-RPA技術(shù)對(duì)設(shè)施匱乏地區(qū)PDCoV檢測具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是一種通過雜交測序的原理進(jìn)行核酸檢測的方法。胡靖飛等[22]建立了能夠同時(shí)檢測PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV四種豬腸道病毒的寡核苷酸芯片，該芯片靈敏度高，最低檢測限為106拷貝/μl，與PRRSV、PCV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV均無交叉反應(yīng)。馬銳等[23]針對(duì)PEDV、TGEV和PRoV設(shè)計(jì)引物，將常規(guī)PCR與不對(duì)稱PCR兩種靶基因標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于可視化芯片，比較兩種方法對(duì)芯片雜交效率的影響，發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱PCR可顯著提高豬腹瀉病毒可視化共檢芯片的雜交效率，為進(jìn)一步提髙可視化芯片的臨床應(yīng)用提供了重要參考。

2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

2.1 中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)(virusneutralization testing)是基于抗原抗體特異性結(jié)合原理檢測病毒的方法。董志珍等[24]分別采用狗直腸瘤細(xì)胞A72和豬腎細(xì)胞PK15培養(yǎng)TGEV用于中和試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，采用A72細(xì)胞的中和試驗(yàn)結(jié)果好于PK15，且與ELISA檢測結(jié)果相一致。為了避免目測對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的差異，Sigh等[25]開發(fā)了一種基于MTT比色法測定PEDV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變檢測方法，該方法適用于病毒中和試驗(yàn)和TCID50的測定，避免了通過目測細(xì)胞病變確定抗體滴度的主觀性，同時(shí)也縮短了實(shí)驗(yàn)室檢測時(shí)間?；跓晒饩劢怪泻蜏y定(fluorescence focusing neutralization, FFN)的方法已經(jīng)在PEDV和PDCoV的中和試驗(yàn)中得到應(yīng)用[26]。Zhang等[27]將PDCoV與熱滅活陽性血清在37 ℃孵育1～2 h，將其混合物添加至豬睪丸細(xì)胞(ST)或豬腎小管上皮細(xì)胞(LLC-PK1)細(xì)胞中，通過熒光染色測定其結(jié)果，該方法降低了人為因素對(duì)細(xì)胞病變判斷的誤差。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是一種較為成熟的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測方法，通過檢測抗原或抗體對(duì)病毒進(jìn)行診斷。Luo等[28]基于PDCoV的M蛋白建立了間接ELISA檢測方法，該方法具有較好的特異性，不與抗TGEV、PEDV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV等病毒抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，能夠用于臨床樣本的檢測。S1蛋白是冠狀病毒S蛋白的亞單位，與病毒的入侵有關(guān)，其抗體能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)，阻止病毒感染。Shan等[29]通過構(gòu)建PEDV S1基因原核表達(dá)質(zhì)粒，建立了基于S1蛋白的間接ELISA方法(rS1-ELISA)，以IFA作為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示rS1-ELISA具有較高的靈敏度和特異性，為PEDV的抗體檢測提供了可靠工具。Zhou等[30,31]利用熒光素酶免疫沉淀系統(tǒng)開發(fā)了一種基于SADS-CoV S1蛋白的快速ELISA抗體檢測方法，可用于SADS-CoV的早期診斷和再次爆發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查。

抗體檢測是豬腸道冠狀病毒診斷的重要方法，納米抗體因其特異性強(qiáng)、親和力高等優(yōu)勢已在醫(yī)藥開發(fā)、臨床診斷等研究中得到廣泛應(yīng)用[32]。Ma等[33]首次開發(fā)出一種帶有生物素PEDV納米抗體的新型阻斷ELISA方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于PEDV的臨床檢測。

為了能夠在同一樣本中區(qū)分出不同的病原，Malbec等[34]開發(fā)了一種類似固相ELISA的多重免疫分析法，通過將PEDV、TGEV和PDCoV的共同序列S1結(jié)構(gòu)域構(gòu)建重組蛋白并固定在96孔板，能夠在單個(gè)樣本中同時(shí)檢測多個(gè)不同的病原。該多重免疫分析法是一種有效、可靠的PEDV、TGEV和PDCoV鑒別診斷方法。

2.3 免疫層析技術(shù)

在免疫層析檢測技術(shù)(immunochromatographyassay, ICA)中，膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，該技術(shù)具有快速、簡便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為基層獸醫(yī)工作者供了有效的檢測手段[35]。李嘉琛等[36]采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，利用兩株單克隆抗體成功研制出檢測TGEV膠體金試紙條，該試紙?zhí)禺愋院?，靈敏度與RT-PCR檢測結(jié)果一致，優(yōu)于進(jìn)口試紙卡。Li等[37]采用純化后的PEDV重組N蛋白與膠體金結(jié)合作為檢測線，研制出一種新的膠體金免疫試紙，能夠在10 min內(nèi)檢測特異性PEDV抗體，靈敏度和特異性均高于ELISA試劑盒。

近年來，關(guān)于PEDV的免疫層析技術(shù)發(fā)展迅速。Bian等[38]利用細(xì)胞表面熒光免疫分析技術(shù)(cell surface fluorescence immunoassay, CSFIA)制備了PEDV單克隆抗體(mAbs)，采用膠體金標(biāo)記的mAb作為檢測信號(hào)，研制了一種新型的免疫層析方法，可用于豬糞便中PEDV的高靈敏檢測。Xu等[39]開發(fā)了一種基于銪納米粒子標(biāo)記單克隆抗體(EuNPs-mAb)熒光探針的免疫色譜分析方法，與傳統(tǒng)熒光試紙相比，使用EuNPs時(shí)背景熒光干擾小，靈敏度提高，用于PEDV檢測時(shí)，檢測限可以達(dá)到0.218 μg/ml(2.725×103TCID50/mL)。

此外，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在豬病檢測方面逐步得到應(yīng)用[40]。武鑫宇等[41]將PEDV、TGEV、PHEV三種冠狀病毒原核表達(dá)純化的N蛋白固定在芯片載體上制備出可視化蛋白芯片，能快速準(zhǔn)確的檢測以上三種病毒，與ELISA檢測結(jié)果符合率達(dá)90%以上，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 展望

SECoV引起的臨床癥狀較為相似，常出現(xiàn)兩種或兩種以上混合感染情況，而且冠狀病毒具有較強(qiáng)的變異性，導(dǎo)致診斷和防控難度加大[42,43]。因此，開發(fā)能同時(shí)鑒別不同SECoV的多重檢測技術(shù)，以及適用于基層快速檢測標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范化的診斷方法對(duì)SECoV的防控至關(guān)重要。

盡管通過病毒的分離和培養(yǎng)鑒定病原結(jié)果可靠，準(zhǔn)確性高，但操作周期長，難以在基層推廣使用。分子生物學(xué)診斷技術(shù)需要特殊的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和專業(yè)技術(shù)人員操作。免疫層析試紙由于其技術(shù)成熟，操作簡便快捷，不需要專業(yè)技術(shù)人員即可完成，非常適合于在基層使用，但在檢測靈敏度和定量方面仍需改善。同時(shí)，應(yīng)加大對(duì)檢測技術(shù)的規(guī)范性和可重復(fù)性的嚴(yán)格把控，以確保檢測結(jié)果的真實(shí)可靠。未來SECoV的檢測將朝著更加便捷化、自動(dòng)化、高通量和低成本方向發(fā)展，為SECoV的防控提供更加可靠的技術(shù)支撐。