骨骼發(fā)育不良的遺傳學(xué)研究進(jìn)展*

吳南

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730；2.骨骼畸形遺傳學(xué)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730；3.疑難重癥及罕見(jiàn)病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

骨骼發(fā)育不良（skeletal dysplasia，SD）是一類影響骨和軟骨組織組成與結(jié)構(gòu)的發(fā)育性疾病，其表現(xiàn)包括巨頭畸形、面中部發(fā)育不良、肢端畸形、身材矮小、關(guān)節(jié)松弛、脊柱側(cè)凸、骨密度異常等，亦可合并其他系統(tǒng)畸形。SD 的出生患病率約為1/5 000，表型嚴(yán)重程度不等，其中成骨不全和軟骨發(fā)育不全相對(duì)常見(jiàn)，而致死的骨骼發(fā)育不良多因胸骨發(fā)育不全、肺無(wú)法正常發(fā)育，導(dǎo)致嬰兒死于呼吸窘迫[1]。由于SD的某些致病基因不僅在骨骼系統(tǒng)發(fā)揮作用，所以SD 患者的聽(tīng)力、視力和神經(jīng)系統(tǒng)等亦會(huì)受累[1]。2019 年，國(guó)際骨骼發(fā)育不良學(xué)會(huì)根據(jù)臨床、影像、分子表型將SD劃分為461 種、42 類[2]。該年修訂的最新版Nosology and classification of genetic skeletal disorders囊括了437種致病基因，較2015年版新增了73種[2,3]。

1 骨骼發(fā)育不良的分子遺傳學(xué)研究前沿進(jìn)展

面對(duì)表型復(fù)雜多樣的SD，分子遺傳學(xué)檢測(cè)可幫助臨床醫(yī)師鑒別診斷疾病的類型和病因。其中成骨不全、綜合征性脊柱側(cè)凸和先天性肢端畸形近年來(lái)在分子遺傳學(xué)方面取得了較多突破性的進(jìn)展。

1.1 成骨不全

成骨不全（osteogenesis imperfecta）又名脆骨病，以骨量低下、骨骼脆性增加和反復(fù)骨折為主要特征，亦可出現(xiàn)身材矮小、藍(lán)色鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全等臨床表現(xiàn)[4]。1979 年，Sillence 等[5]根據(jù)臨床嚴(yán)重程度將其為4類亞型，之后發(fā)現(xiàn)的Ⅴ型成骨不全則具有肥厚性骨痂、骨間膜鈣化等獨(dú)特臨床表現(xiàn)，此分類未考慮遺傳因素。已知超85%的成骨不全是由編碼Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈的COL1A1或編碼α2 鏈的COL1A2突變所致，為常染色體顯性遺傳[6,7]。

近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，除COL1A1/2外，又發(fā)現(xiàn)了二十余個(gè)導(dǎo)致成骨不全的基因，為常染色體顯性、隱性或X連鎖遺傳[8]。2018年，Doyard 等[9]報(bào)道了在4 位成骨不全患者身上發(fā)現(xiàn)的FAM46A純合突變，表明FAM46A突變可導(dǎo)致伴有先天性下肢彎曲的表型嚴(yán)重的成骨不全。2020年，Dubail等[10]在兩個(gè)無(wú)血緣關(guān)系家族中的三位患者中發(fā)現(xiàn)CCDC134純合功能缺失突變導(dǎo)致嚴(yán)重的Ⅲ型成骨不全。此外，近年來(lái)已報(bào)道的可導(dǎo)致成骨不全的基因還包括CRTAP、CREB3L1、IFITM5、LEPRE1、P3H1、PPIB、SERPINF1、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、WNT1、SPARC、MBTPS2、MESD、SEC24D、P4HB、PLOD2、PLS3和KDELR2等[8,11]。這些基因涉及膠原蛋白的合成、加工和交聯(lián)或影響成骨細(xì)胞的分化和功能，致病的具體分子機(jī)制尚未完全清楚，但它們通過(guò)各種機(jī)制最終影響了Ⅰ型膠原蛋白的質(zhì)量或數(shù)量[6,8]。2019 年，Maioli 等[12]報(bào)道了在394 例意大利成骨不全患者中進(jìn)行的基因型表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，指出影響Ⅰ型膠原蛋白數(shù)量的突變多導(dǎo)致Ⅰ型成骨不全，而影響膠原蛋白功能的突變與Ⅱ～Ⅳ型成骨不全顯著相關(guān)。隨著越來(lái)越多致病基因的發(fā)現(xiàn)，為了精確成骨不全的分類，推動(dòng)基因靶向治療的研究，學(xué)者們將致病基因納為成骨不全分型的依據(jù)。Forlino等[6]指出可以根據(jù)致病基因影響的代謝途徑將成骨不全分為五類，前三類分別影響膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和加工、翻譯后修飾、折疊和交聯(lián)，第四類影響骨化或礦化，第五類會(huì)造成成骨細(xì)胞分化缺陷。

1.2 綜合征性脊柱側(cè)凸

近期我們通過(guò)大規(guī)模全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)約10%的早發(fā)型脊柱側(cè)凸患者為綜合征性脊柱側(cè)凸（syndromic scoliosis），致病基因包括NF1、FGFR3、PLOD1等[13]。典型的具有脊柱側(cè)凸表現(xiàn)的綜合征包括結(jié)締組織疾病，如馬方綜合征（Marfan syndrome）和Ehlers-Danlos 綜合征（Ehlers-Danlos syndrome），以及1 型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1），Prader-Willi綜合征（Prader-Willi syndrome）等。

1.2.1 馬方綜合征

是一種累及骨骼、心血管及眼三大系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳病，主要表現(xiàn)為主動(dòng)脈瘤和夾層、晶狀體異位、蜘蛛樣指（趾）、身材瘦高、關(guān)節(jié)活動(dòng)過(guò)度、胸廓畸形、脊柱側(cè)凸或后凸畸形，也可累及神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚和肺[14,15]。超90%的患者存在FBN1突變，F(xiàn)BN1位于15q21.1，總長(zhǎng)度為200 kb，編碼長(zhǎng)度為8 kb，包含66個(gè)外顯子，編碼原纖維蛋白-1，致病機(jī)制為單倍劑量不足或顯性負(fù)效應(yīng)[16]。

近期研究表明，F(xiàn)BN1基因第65/66 外顯子雜合突變的患者除典型的馬方癥狀外，還有嚴(yán)重的脂肪營(yíng)養(yǎng)不良，稱為馬方樣-早衰樣-脂肪營(yíng)養(yǎng)不良綜合征（marfanoid-progeroid-lipodystrophy syndrome，MPLS）[17]。2021年，Arnaud等[18]報(bào)道了在1575例馬方綜合征患者的隊(duì)列進(jìn)行的基因型表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)FBN1終止突變（premature termination codon mutations，PTC）的患者有更嚴(yán)重的主動(dòng)脈表型，且預(yù)期壽命更短，而具有框內(nèi)突變（in frame muta?tion）的患者根據(jù)突變對(duì)半胱氨酸數(shù)量的影響具有不同的特征，其中半胱氨酸減少的患者各系統(tǒng)受累更為嚴(yán)重。臨床診斷馬方綜合征需綜合考慮眼、心血管和骨骼系統(tǒng)的累及程度、家族史和是否攜帶致病FBN1突變[19]。

1.2.2 Ehlers-Danlos綜合征

是先天性結(jié)締組織發(fā)育不全性疾病，主要癥狀為皮膚彈性過(guò)強(qiáng)、關(guān)節(jié)活動(dòng)度異常增大和血管等組織脆性增加[20]。2017年，Malfait 等[21]制定了最新版的Ehlers-Danlos綜合征國(guó)際分類標(biāo)準(zhǔn)，以臨床表現(xiàn)為主要根據(jù)將其分為13 種亞型，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了分子診斷的重要性。13 種亞型中，除hypermobile Ehlers-Danlos綜合征外，其余亞型均已明確分子機(jī)制[21]。其中，ky?phoscoliotic Ehlers-Danlos 綜合征（kEDS）具有脊柱側(cè)后凸的表型，是由PLOD1純和或復(fù)合雜合突變引起的[22,23]。PLOD1基因編碼賴氨酸羥化酶，對(duì)膠原的正常形成至關(guān)重要。

2018 年，Giunta 等[24]報(bào)道了一個(gè)17 人的kEDS 隊(duì)列，表明FKBP14的雙等位基因突變也會(huì)導(dǎo)致kEDS。PLOD1和FKBP14突變導(dǎo)致的kEDS 臨床特征一致，不易區(qū)分，但FKBP14-kEDS 患者具有聽(tīng)力障礙。2019年，Lim等[25]利用原始皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)兩類kEDS進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)編碼細(xì)胞外基質(zhì)的基因存在顯著的表達(dá)差異。研究者還通過(guò)定量RT-PCR驗(yàn)證了FKBP14-kEDS患者中ALDH1A3的表達(dá)增強(qiáng)，而ALDH1A3與聽(tīng)力障礙之間存在分子聯(lián)系，這值得進(jìn)一步探究[25]。

1.2.3 1型神經(jīng)纖維瘤病

是累及皮膚、骨骼、神經(jīng)、心臟、眼等多個(gè)系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳病，多發(fā)牛奶咖啡斑和神經(jīng)纖維瘤是其特征性表現(xiàn)，脊柱側(cè)凸是其最常見(jiàn)的骨骼表現(xiàn)[26]。1 型神經(jīng)纖維瘤病的致病基因是位于17q11.2的腫瘤抑制基因NF1，該基因編碼神經(jīng)纖維瘤蛋白。神經(jīng)纖維瘤蛋白在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，是一種GTPase 激活蛋白（GTPase-activat?ing protein，GAP），可激活GTPase 進(jìn)而催化有活性的RAS-GTP 轉(zhuǎn)化為非活性的RAS-GDP，從而抑制Ras活性[27]。NF1突變導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤蛋白失活進(jìn)而增強(qiáng)RAS 信號(hào)以及其下游的絲裂原激活蛋白激酶（mi?togen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）等效應(yīng)通路，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和分化[27,28]。

近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，NF1基因靶向測(cè)序和致病突變的分析成為鑒別診斷1 型神經(jīng)纖維瘤病的新手段。2018年，Wu等[29]對(duì)100例疑似1型神經(jīng)纖維瘤病的患者進(jìn)行靶向測(cè)序，檢測(cè)到73 個(gè)NF1突變。2020 年，Bianchessi 等[30]同樣利靶向測(cè)序?qū)?50例疑似1 型神經(jīng)纖維瘤病的患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有168例患者攜帶NF1致病突變。

此外，近年來(lái)針對(duì)NF1所影響的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路研發(fā)的靶向藥物也取得了巨大的成功。2016 年，Dombi 等[31]進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)以確定口服MAPK 激酶的選擇性抑制劑：司美替尼（Selumetinib）的最大耐受劑量并評(píng)估其血漿藥代動(dòng)力學(xué)，該試驗(yàn)納入24例1型神經(jīng)纖維瘤病患者。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該藥物可以緩解患者的疼痛、減輕患者外形異常和身體功能障礙，并且未發(fā)現(xiàn)過(guò)度的毒副作用[31]。2020年，司美替尼成為首個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的治療1型神經(jīng)纖維瘤病的靶向藥物[32]。

1.3 先天性肢端畸形

先天性肢端畸形包括短指（趾）（brachydactyly，BD）、并多指（趾）（synpolydactyly，SPD）和巨指（趾）畸形（macrodactyly）等。BD分為A～E五型，各型又含若干亞型，多為常染色體顯性遺傳[33]。

多年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)了許多導(dǎo)致BD的致病基因，呂趙劼等[34]對(duì)此進(jìn)行了總結(jié)，包括IHH、GDF5、BMPR1B、BMP2、ROR2、HOXD13和PTHLH等多個(gè)基因[34]。SPD為常染色體顯性遺傳，HOXD13突變、FBLN1基因斷裂均可導(dǎo)致SPD[35]。2019年，Du等[36]在中國(guó)一個(gè)六代的家系中證明了TTC30B與SPD 相關(guān)。巨指（趾）畸形的機(jī)制尚未充分明確，已知的致病基因有包括PIK3CA、AKT1等[37,38]。2020年，我們的一項(xiàng)研究納入24 例單純性巨指（趾）畸形的患者，通過(guò)下一代測(cè)序發(fā)現(xiàn)所有患者均攜帶嵌合型PIK3CA或AKT1突變[39]。近年的兩項(xiàng)研究探索了PIK3CA突變導(dǎo)致巨指（趾）畸形的具體機(jī)制：Sun等[40]發(fā)現(xiàn)PIK3CA激活突變會(huì)上調(diào)E2F2，進(jìn)而促進(jìn)脂肪在巨指（趾）處的累積。Cui 等[41]發(fā)現(xiàn)PIK3CA 激活突變可通過(guò)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)巨指（趾）處的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化成骨。

2 遺傳檢測(cè)的臨床應(yīng)用

探索和明確SD 的致病基因和分子機(jī)制，可幫助臨床醫(yī)師鑒別診斷疾病的類型和病因，也是研究改進(jìn)治療方案、開(kāi)展遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷的基礎(chǔ)。

根據(jù)致病基因?qū)Ρ硇蛷?fù)雜的SD進(jìn)行分類有利于臨床上進(jìn)行精確診斷。如馬方綜合征、EDS等這類臨床表型復(fù)雜且具有重疊性的疾病，分子診斷已成為了明確診斷的必要依據(jù)[19,21]。面對(duì)臨床表型相似但疾病進(jìn)程存在明顯差異的疾病，明確的分子診斷可以幫助醫(yī)師選擇治療方案、決定臨床管理方案。例如NF1突變和SPRED突變的患者都會(huì)出現(xiàn)咖啡斑和腋窩雀斑，但是其罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)明顯不同，因此通過(guò)分子診斷鑒別兩基因突變分別導(dǎo)致的1 型神經(jīng)纖維瘤病和Legius綜合征十分必要[42]。2019年，Giuglia?no 等[43]對(duì)281 名具有神經(jīng)皮膚異常表型的患者采取了靶向測(cè)序和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex liga?tion-dependent probe amplification，MLPA）等技術(shù)手段進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分別有73.3%和2.8%的患者具有NF1和SPERD突變，成功區(qū)分了一部分只有色素沉著表型的患者。2019年，通過(guò)建立基因組-表型關(guān)聯(lián)分析，我們根據(jù)致病基因定義了一種全新的先天性脊柱側(cè)凸亞型——TBX6相關(guān)先天性脊柱側(cè)凸（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）[44]。在此之前，我們的研究發(fā)現(xiàn)約10%的先天性脊柱側(cè)凸是由TBX6無(wú)效突變聯(lián)合一個(gè)亞效等位基因共同導(dǎo)致的[45]。目前，我們開(kāi)發(fā)的TACS 分子診斷及臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型已融入臨床診療流程，實(shí)現(xiàn)了TACS的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，提升了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本[46]。

明確的致病機(jī)制有利于推進(jìn)靶向藥物的研發(fā)，改進(jìn)治療方案。除了司美替尼，近年來(lái)還有許多靶向藥物已經(jīng)研發(fā)成功并獲批上市。布羅索尼單抗（Burosumab）是治療X 連鎖低磷血癥（X linked hypo?phosphatemic rickets，XLH）的靶向藥物，臨床試驗(yàn)表明該藥物可以改善兒童和成人患者的身體機(jī)能、生化指標(biāo)并減輕疼痛，且治療效果顯著優(yōu)于常規(guī)治療[47-49]。Burosumab 在2018 年被FDA 批準(zhǔn)上市[50]，并在2021 年1 月獲批在中國(guó)上市。此外，用于治療骨質(zhì)疏松的地舒單抗（Denosumab）和用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的托法替布（Tofaci?tinib）已廣泛應(yīng)用于臨床[51,52]。

遺傳咨詢可幫助患者正確認(rèn)識(shí)疾病，了解自身或后代的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)了解患者的家族史，結(jié)合考慮其所患疾病的遺傳模式和分子機(jī)制，可建議患者選擇靶向測(cè)序、全外顯子組測(cè)序（whole exome se?quencing，WES）或全基因組測(cè)序（whole genome se?quencing，WGS）以明確致病基因，進(jìn)行針對(duì)性的靶向治療。對(duì)于有生育需求的患者，可告知其遺傳風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)建議其選擇體外受精，進(jìn)行植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）[53]。對(duì)于選擇自然受孕的患者，也應(yīng)建議其在孕早期利用WES 等手段進(jìn)行產(chǎn)前診斷[54]?；谇捌诘难芯亢团R床工作基礎(chǔ)，我們?cè)诒本﹨f(xié)和醫(yī)院開(kāi)設(shè)了骨骼畸形遺傳門診，可為患有SD 等骨骼系統(tǒng)相關(guān)遺傳性疾病的患者提供咨詢。

3 展望

近年來(lái)，SD 的分子遺傳學(xué)研究取得了諸多突破性的進(jìn)展，但目前仍有一定占比的SD 患者缺乏分子診斷，SD 的致病基因庫(kù)仍待豐富和完善。隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序通量和深度顯著提升，而測(cè)序成本大幅降低。WES 和WGS 等新一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)被愈加廣泛地應(yīng)用于SD患者的分子診斷。相較于WES，WGS可以準(zhǔn)確檢測(cè)出內(nèi)含子和非編碼區(qū)的異常，具有廣泛的應(yīng)用前景。2020 年，Turro 等[55]分析了一萬(wàn)三千多名罕見(jiàn)病患者的WGS數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)非編碼突變，它們通過(guò)影響其他基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致疾病的發(fā)生。Thavebthiran 等[56]對(duì)1318 例原發(fā)性免疫缺陷（primary immunodeficiency，PID）患者進(jìn)行了WGS，發(fā)現(xiàn)調(diào)控區(qū)的缺失與疾病的發(fā)生相關(guān)。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)位于PTPN2和SOCS1位點(diǎn)的常見(jiàn)變異影響了PID患者的外顯率和表現(xiàn)度[56]。由此可見(jiàn)，將WGS應(yīng)用于SD患者的分子診斷有望幫助研究人員揭露新的更為復(fù)雜的SD致病機(jī)制。

隨著SD 致病基因庫(kù)的豐富和完善，未來(lái)可以利用分子分型對(duì)表型復(fù)雜的SD患者進(jìn)行更為精細(xì)準(zhǔn)確的分類。致病機(jī)制的不斷揭示，也會(huì)為將來(lái)治療手段的研發(fā)提供夯實(shí)的理論基礎(chǔ)。