蘭州地方分離PCV毒株ORF2閱讀框的測序分析與原核表達鑒定

傅 昱，郝曉芳，盧曾軍，孫 普，胡永浩，劉在新

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730070）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、母豬繁殖障礙（Sow abortion and mortality syndrome，SAMS）、豬皮膚腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、呼吸道綜合征等相關(guān)疾病的重要病原[1-2]。PCV2是一種免疫抑制性病毒，損害感染豬的免疫功能，引起繼發(fā)或者合并感染，對牲豬養(yǎng)殖業(yè)造成了難以估計的損失，該病毒已成為制約我國牲豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原之一[3]。由于病毒經(jīng)常是并發(fā)感染，以亞臨床感染形式出現(xiàn)，所以在很長的一個時期內(nèi)往往被人們所忽視，因此進一步加強對PCV病毒的流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究顯得尤為重要[4]。

PCV病毒的ORF2閱讀框表達的蛋白具有較好的免疫原性，并且該蛋白在兩型病毒之間的同源性可達到68%。Nawagitgul P等將ORF2基因克隆到桿狀病毒表達載體,在昆蟲細胞中表達了ORF2主要結(jié)構(gòu)蛋白,相對分子質(zhì)量為30 KDa,與在純化的病毒粒子中檢測到的相似,并在電鏡下觀察到重組的ORF2蛋白自身裝配成衣殼樣粒子,從而進一步證實ORF2基因編碼病毒的衣殼蛋白[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭州本地病毒分離株來自筆者在實驗室保存的PK15細胞系和蘭州地方某豬場的4份患PMWS的仔豬組織病料；pGEM-T Easy載體、BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶、DH-5 α感受態(tài)細胞購自大連寶生物工程有限公司；pET-32 a載體購自Novagen公司；BL21感受態(tài)細胞購自Promega公司；IPTG等其余實驗所用試劑由本實驗室保存并提供；DNA提取試劑盒和PCR試劑盒購自上海生工；質(zhì)粒提取試劑盒購自BioDev公司；凝膠回收試劑盒購自AxyGen公司；引物P1，P2由上海生工生物有限公司按要求合成；PCV病毒ORF2序列的優(yōu)化合成序列由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 本地分離毒株ORF2片段PCR檢測分析根據(jù)GenBank所查的PCV病毒兩個型的ORF2的序列，設(shè)計了一對共用引物：P1：5′—TTCTCTGAATTGTA CAT—3′；P2：5′—CAAGGAGGCGTTACCGCAG—3′。進行了PCR擴增檢測，將陽性病料接種于PK15細胞。盲傳5代后收毒進行PCR擴增后回收、連接pGEM-T Easy載體、轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細胞得到重組質(zhì)粒進行序列測定和同源性分析。回收操作按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書，質(zhì)粒提取按照BioDev-Tech試劑盒說明書。

1.2.2 本地毒株ORF2序列的改造和合成 結(jié)合GenBank 所查 EU418627、DQ915583、EF565346 和GQ911590等4個PCV2的ORF2序列，對本地毒株ORF2序列進行了改造，將序列長度增長，加入PCV2的ORF2幾個特異性的抗原表位序列，這樣改造是由于在PCV2發(fā)病的仔豬組織中可以同時檢測出大量的PCV1[6]，表明PCV1和PCV2的共存性，但是由于PCV2對致病性起決定性作用，所以序列要更好的針對PCV2的ORF2序列。應(yīng)用DNAstar序列分析軟件分析，對測序結(jié)果進行改造加入PCV2的ORF2特異性表位序列，并對稀有密碼子進行改造（表1）。

表1 密碼子的改造

1.2.3 合成后重組質(zhì)粒的檢測及pET-32a載體的連接 重組質(zhì)粒菌液接種于氨芐培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后挑選菌落提取質(zhì)粒，對陽性質(zhì)粒進行了BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，同時pET-32a空載體也進行了BamH I和EcoR I雙酶切，然后將目的ORF2序列回收后連接到pET-32a表達載體多克隆位點中。

1.2.4 ORF2-pET 32 a重組質(zhì)粒的獲得及轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物ORF2-pET 32a轉(zhuǎn)化到DH5α通用感受態(tài)細胞中，并進行氨芐培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后通過質(zhì)粒提取操作得到了陽性重組質(zhì)粒ORF2-pET 32a。再將ORF2-pET 32a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，得到BL21(DE3)中陽性重組質(zhì)粒。

1.2.5 ORF2-pET 32a的表達鑒定 挑取含ORF2-pET 32 a陽性重組質(zhì)粒的BL21(DE3)重組表達菌的單個菌落，接種于含氨芐青霉素（AMP）的液體LB培養(yǎng)基中，25℃ ，200 r/min低溫振蕩培養(yǎng)至 OD600為 0.6～0.7（約 2 h）時，加入 2 mmol/L的 IPTG（Isopropylthio-β-D-galactoside） 后繼續(xù)25℃誘導(dǎo)表達5 h,取表達產(chǎn)物按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 融合表達產(chǎn)物的可溶性分析 采用以上方法將誘導(dǎo)表達產(chǎn)物于4℃10 000 r/min低溫離心10 min，收集誘導(dǎo)表達菌體加入PBS溶液，于冰浴中25%強度，8 s超聲破碎8 s。停止冷卻，循環(huán)超聲破碎45 min，超聲結(jié)束后于4℃，10 000 r/min低溫離心10 min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定融合表達產(chǎn)物的可溶性。PBS溶液按常規(guī)劑量自行配制。

1.2.7 重組融合蛋白的純化及濃度的測定 經(jīng)可溶性鑒定該表達產(chǎn)物主要以上清的形式存在，將擴大誘導(dǎo)培養(yǎng)后額菌液以10 000 r/min離心10 min，超聲破碎取上清。使用ProBond TM純化柱進行純化，具體純化方法見Invitrogen公司的Ni+純化手冊。對純化后產(chǎn)物用蛋白核酸定量儀測定蛋白質(zhì)樣品在260 nm和280 nm波長的光吸收值，按照以下計算樣品中蛋白質(zhì)含量的公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45×A280－0.74×A260。測定濃度后的產(chǎn)物小量分裝凍存于-40℃。純化用液按Invitrogen公司的Ni+純化手冊，由本研究自行配制。

1.2.8 純化后重組融合蛋白的Western blotting分析 根據(jù)蛋白技術(shù)手冊所介紹的蛋白質(zhì)免疫印跡法的操作步驟安裝轉(zhuǎn)印裝置，將SDS-PAGE電泳的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜（NC）上，用含1%BSA的TBST溶液封閉，以PCV2豬陽性血清為一抗，HPR標記的兔抗豬IgG為二抗，DAB(2 mg NiCl2，15 μL 30%H2O2，5 mL 0.01 mol/L Tris-HCl（pH=7.6）液體避光染色，并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 本地分離毒株ORF2片段PCR檢測、酶切鑒定

將接毒后病變PK細胞液提取的重組質(zhì)粒用Hind III和BamH I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切后，進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳結(jié)果圖（圖1）。結(jié)果表明，本地分離毒株中有PCV病毒的存在。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

該片段測序后經(jīng)GenBank序列比對及DNAstar軟件分析，結(jié)果表明，本地分離毒株為PCV1毒株，毒株ORF2序列長度662 bp，編碼了221個氨基酸。測序分析后發(fā)現(xiàn)分離毒株序列與PCV1的ORF2序列同源性達到99.1%～99.4%。

2.2 重組質(zhì)粒的檢測及pET-32a載體的連接

將改造合成后的本地毒株ORF2序列重組質(zhì)粒進行BamH I和EcoR I雙酶切鑒定（圖2）。將酶切后ORF2片段連接pET-32a多克隆載體，通過雙酶切鑒定電泳（圖3）。如圖所示，目的ORF2片段已經(jīng)準確的連入pET-32a載體。

圖2 重組質(zhì)粒pUC-ORF2的酶切鑒定

圖3 ORF2-pET 32a雙酶切鑒定

2.3 ORF2-pET 32a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21后的表達鑒定

將轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中的陽性O(shè)RF2-pET 32a重組質(zhì)粒單菌落進行誘導(dǎo)表達，將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后培養(yǎng)物分別取出1.0 mL并收集菌體進行SDSPAGE分析，電泳分析結(jié)果（圖4）。

圖4 重組蛋白SDS-PAGE分析

由SDS-PAGE電泳圖可以看出，重組菌在誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條大約為50 kDa的蛋白條帶，大小與預(yù)期的融合蛋白分子量基本一致，這表明誘導(dǎo)表達得到了所需的ORF2-pET 32a表達蛋白。

2.4 融合表達產(chǎn)物的可溶性分析

將誘導(dǎo)表達產(chǎn)物收集菌體超聲破碎后離心得到上清液和包涵體沉淀，對其進行了SDS-PAGE分析（圖5），表明目的融合蛋白重要存在于上清液中。

2.5 重組融合蛋白的純化及濃度測定

對重組融合蛋白進行了純化操作，純化后SDS-PAGE電泳（圖6），圖中純化后有一條明顯的50 KDa左右的條帶，表明純化效果良好。對蛋白進行蛋白核酸定量儀測定，按照計算公式得出蛋白的濃度達到459 μg/mL，達到了純化蛋白濃度的預(yù)期目的。

圖5 ORF2-pET 32a融合蛋白可溶性鑒定

圖6 重組融合蛋白純化后的SDS-PAGE檢測

2.6 Western blotting分析

對重組融合蛋白的純化產(chǎn)物進行了Western blotting分析（圖7）。結(jié)果表明，NC濾膜上在50 kDa的目標條帶位置上出現(xiàn)了一條明顯的棕色印跡，而pET 32a空載體轉(zhuǎn)化菌落在相應(yīng)的50 kDa并沒有出現(xiàn)任何條帶，說明該純化后的重組融合蛋白可以特異性的被多克隆抗體識別，重組融合蛋白的抗原性良好。

圖7 純化產(chǎn)物Western blotting分析

3 討論

3.1 對蘭州本地毒株的檢測和鑒定分析

由于采集的病料分離毒株毒力較弱，運輸環(huán)節(jié)儲存時間較長，病毒的數(shù)量較少，從而導(dǎo)致PCR擴增不敏感、基因組擴增和克隆不穩(wěn)定，因此本研究將分離毒株細胞毒復(fù)蘇，重新接種于PK15細胞上，進行病毒的增值培養(yǎng)和傳代，待病毒增值在PK15細胞中穩(wěn)定以后，將獲得的新鮮病毒用于PCR檢測。研究表明PK15細胞是體外培養(yǎng)PCV的良好細胞株，PCV1和PCV2在PK15細胞上復(fù)制，都不產(chǎn)生細胞病變（CPE）[7]。PCV可以來源于骨髓、外周血液、肺洗液和淋巴結(jié)的單核、巨噬細胞中。本試驗從蘭州本地病料分離株提取出來DNA進行擴增，對擴增后的ORF2序列進行了測序，對測序結(jié)果和幾個genbank登錄毒株的ORF2進行了比較分析，ORF2序列的長度為662 bp，可以表達221個氨基酸。根據(jù)DNAstar軟件中MegAlign的分析，本地分離株ORF2的序列與PCV1的ORF2序列EF533941，F(xiàn)J475129，DQ648032 和 AY193712 的同源性達到了99.1%～99.4%，而與PCV2的ORF2序列 EF565346，GQ911590，EU418627 和 DQ915583的同源性是68.1%～68.6%。這個結(jié)果表明蘭州本地分離株的ORF2測序結(jié)果判定病毒為PCV1病毒。此項工作為蘭州本地區(qū)PCV病毒的流行病調(diào)查研究工作做出了一定的補充。

對本地株ORF2序列的改造，遵循了使改造后基因表達的蛋白更好的特異性的識別PCV2病毒的原則，同時對PCV2基因疫苗的制備做一些前期的準備工作。據(jù)文獻報道，ORF2所編碼核衣殼蛋白的65 aa～87 aa、113 aa～147 aa、157 aa～183 aa區(qū)域及 C端的4個氨基酸殘基為重要的抗原結(jié)構(gòu)[8-9]。對非以上抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域的稀有密碼子進行了改造，目的是為了更有利于基因的表達得到重組融合蛋白。改造后合成的ORF2序列可以指導(dǎo)234個氨基酸的合成。根據(jù)文獻上報道的ORF2基因編碼的N端41位氨基酸為核定位信號[10]，將此區(qū)域的密碼盡量保證為原始編碼，這樣能更好的保證其指導(dǎo)表達的蛋白的抗原性。

3.2 對改造合成基因的表達、純化和分析

T7表達系統(tǒng)是目前所有表達系統(tǒng)中公認的表達效果最好的系統(tǒng)，也是世界各國基因研究中應(yīng)用最多的表達系統(tǒng)。pET系列是典型的代表，其中pET 32a是目前在獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用的比較廣泛的一種，在基因表達領(lǐng)域，膜蛋白的原核表達是一個公認的瓶頸[11]。pET 32a是含有T7啟動子和Amp（氨芐）抗性基因的原核高效表達載體，表達后的融合蛋白帶有His·Tag標簽受lac阻斷物的調(diào)節(jié)，在含有l(wèi)acI基因編碼的宿主菌中可以用IPTG去抑制，在對數(shù)生長期（OD600=0.6）加入誘導(dǎo)劑IPTG后基因開始表達。根據(jù)蛋白可溶性分析，本研究表達融合重組蛋白是可溶性形式存在，雖然富集純化過程較為簡單，但是可溶性的蛋白在純化過程中更容易收到蛋白水解酶的影響，所以在純化和存放的時候在融合中要按1/1 000的比例加入蛋白酶抑制劑。并保證操作過程中溫度角度，而且試驗步驟要盡量縮短操作和靜止時間[12]。

表達時運用了BL21（DE3）宿主細胞，是因為BL21（DE3） 宿主細胞可識別 AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA 6種稀有密碼子，而基因合成前的進行基因改造時就考慮到了以上情況，對核定位區(qū)等重要區(qū)域盡量保證其為原始編碼，并對其他區(qū)域表達相同氨基酸的密碼子盡量改造為宿主細胞可識別的密碼子。融合表達蛋白的可溶性受基因本身、誘導(dǎo)條件、環(huán)境條件等因素的影響，本研究中使用的是25℃，220 r/min的低溫誘導(dǎo)表達方式獲得了可溶性表達蛋白。根據(jù)文獻所述，基因組成是影響表達和蛋白質(zhì)可溶性的重要因素[13]。

鎳螯合層析可以在超聲破碎后變性條件下純化帶有His·Tag標簽的重組蛋白。而重組蛋白N端或者C端帶有一個或者多個組氨酸（由密碼子CAT和CAC編碼）時[14]，其具有強的鎳離子親和力，作用甚至大于抗原抗體的親和力。一些不帶有His·Tag標簽，但組氨酸位于蛋白結(jié)構(gòu)表面的、具有較強可近性的蛋白也可以與鎳離子發(fā)生結(jié)合，所以鎳螯合層析純化常出現(xiàn)較強的非特異性雜蛋白影響純化效果。本研究SDS-PAGE電泳中第1電泳道隱約能看到的雜帶可能就是由于以上原因，但是由于與目的蛋白距離較遠，可以后期進行切膠純化去除，對純化效果影響較小。用PCV2陽性多克隆豬血清對純化后的重組融合蛋白與誘導(dǎo)后的重組融合蛋白進行了Western blotting免疫檢測分析，結(jié)果表明，純化后蛋白特異性的識別PCV2的多克隆陽性血清，但除了目的蛋白條帶外，隱約還有其他菌體蛋白條帶也與PCV2病毒多克隆陽性血清抗體呈較弱的陽性反應(yīng)，這可能因為陽性血清中含有針對大腸桿菌菌體蛋白的抗體。融合蛋白的成功純化和Western blotting分析為PCV2感染臨床診斷和PCV2檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)，也為PCV2基因疫苗的制備補充了理論依據(jù)。

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