超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紙制食品接觸材料中丙烯酰胺的遷移量

錢(qián) 凱，李偉濤，葛文秀，劉麗娜，陳 明，李金鳳

（1．常州工業(yè)及消費(fèi)品檢驗(yàn)有限公司，江蘇 常州 213000；2．南京海關(guān)危險(xiǎn)貨物與包裝檢測(cè)中心，江蘇 常州 213000）

丙烯酰胺（AM）是聚合生成聚丙烯酰胺（PAM）的起始化合物。聚丙烯酰胺作為造紙行業(yè)最早使用的添加劑，被廣泛用作助留劑、助濾劑等，并能提高紙張強(qiáng)度[1－3]。在自然條件下，聚丙烯酰胺會(huì)緩慢降解成丙烯酰胺[3－5]，而殘留的丙烯酰胺單體會(huì)隨著聚丙烯酰胺終產(chǎn)物引入紙制品中，在與食品接觸過(guò)程中不斷被遷移出來(lái)。丙烯酰胺屬于水溶性有機(jī)化合物，滲透性較強(qiáng)，可通過(guò)消化道、呼吸道、粘膜、皮膚等多種途徑被人體吸收[1,6]，存在慢性中毒的安全隱患。研究顯示，丙烯酰胺具有神經(jīng)、生殖、遺傳等毒性，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2類致癌物[2,4,7－8]。因此，我國(guó)在GB 9685－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]中明確規(guī)定了丙烯酰胺的特定遷移限量為不得檢出（檢出限為0．01 mg/kg）。

目前，公眾對(duì)丙烯酰胺的關(guān)注主要來(lái)自食品、環(huán)境、紡織品和化妝品等領(lǐng)域[7,10－15]，而關(guān)于紙制食品接觸材料的安全性問(wèn)題卻鮮有報(bào)道。隨著人們對(duì)塑料污染的認(rèn)識(shí)及環(huán)保意識(shí)的提高，紙類食品接觸材料由于易降解、可回收等特點(diǎn)逐漸受到市場(chǎng)青睞，成為人們?nèi)粘Ｉ钣闷返摹靶聦檭骸?。我?guó)對(duì)食品接觸材料及制品中丙烯酰胺遷移量的測(cè)定方法主要為高效液相色譜法，其原理是采用離子排斥色譜柱和紫外檢測(cè)器進(jìn)行分離和檢測(cè)[16]。由于不同食品模擬物存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，尤其是酒精類食品模擬物含有機(jī)成分，會(huì)對(duì)離子排斥色譜柱的分離性能造成影響，導(dǎo)致方法檢出限無(wú)法滿足要求，定性定量結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題。除液相色譜法外，國(guó)內(nèi)外對(duì)于丙烯酰胺的測(cè)定主要采用氣相色譜法、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法等[8,17－18]。其中，氣相色譜法、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法普遍需進(jìn)行衍生化和固相萃取等處理，操作步驟較繁瑣；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法具有操作簡(jiǎn)便、選擇性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境等領(lǐng)域[1,11－12,19－21]，但鮮見(jiàn)關(guān)于紙制食品接觸材料的報(bào)道。

本研究采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了紙制食品接觸材料中丙烯酰胺遷移量的測(cè)定方法。并進(jìn)行了方法優(yōu)化，有效解決了基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題，對(duì)評(píng)估紙及紙制食品接觸材料中丙烯酰胺遷移的合規(guī)性和風(fēng)險(xiǎn)性具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司）；光譜純甲醇、色譜純甲酸（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；橄欖油（化學(xué)純，上海泰坦科技股份有限公司）；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（1 000μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

一次性針式注射器（5 mL）、親水PTFE針式濾器（0．22μm）購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

隨機(jī)采集具有代表性的不同類型紙制食品接觸材料樣品，共20批次。其中淋膜紙杯5批、淋膜紙碗5批、紙基復(fù)合包裝袋5批、紙吸管5批。每個(gè)樣品平行采集2份。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290高效液相色譜儀及Agilent 6460 QQQ三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；XS205DU萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli－Q Advantage純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 遷移實(shí)驗(yàn)按GB 31604．1－2015[22]和GB 5009．156－2016[23]的要求，分別采用4%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙酸溶液模擬酸性食品，采用水、10%乙醇溶液、20%乙醇溶液、50%乙醇溶液模擬水和酒精類食品（以下稱水溶性食品模擬物），用精制橄欖油模擬油脂類食品（以下稱油性食品模擬物），對(duì)紙制食品接觸材料及制品進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。所得模擬物充分混勻，用于以下分析測(cè)試。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液（5 mg/L）：準(zhǔn)確移取50μL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（1 000μg/mL）于10 mL容量瓶中，分別用相應(yīng)水溶性食品模擬物定容至刻度。

水溶性食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液（5 mg/L）0、10、20、60、100、160、200μL于10 mL容量瓶中，分別用相應(yīng)水溶性食品模擬物定容，得到丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別為0、5、10、30、50、80、100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

油性食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別稱取5 g橄欖油（精確至0．01 g）于6個(gè)帶蓋玻璃離心管中，離心管中分別加入丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液（5 mg/L）0、10、20、50、100、200μL并混勻，加入5 mL水渦旋振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min后，取下層水溶液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾至2 mL進(jìn)樣小瓶，得到丙烯酰胺含量分別為0、10、20、50、100、200μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.3 樣品前處理水溶性食品模擬物試液的制備：取1～2 mL水溶性食品模擬物試液，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾至2 mL進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

油性食品模擬物試液的制備：準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0．01 g）油性食品模擬物試液至帶蓋玻璃離心管中，加入5 mL水渦旋振蕩1 min進(jìn)行液液萃取，4 000 r/min離心5 min后，取下層水溶液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾至2 mL進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

1.3.4 液相色譜條件色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB－Aq（4．6 mm×100 mm，2．7μm）；流動(dòng)相：0．1%甲酸水溶液－甲醇（9∶1，體積比）；洗脫方式：等度洗脫；流速：0．6 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μL。

1.3.5 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣壓力：310 264 Pa（45 psi）；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：10 L/min；毛細(xì)管電壓：2 500 V；電噴嘴電壓：1 000 V；碰撞氣為氮?dú)?；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），正離子模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇丙烯酰胺是一種親水的強(qiáng)極性化合物，在普通C18液相色譜柱上難以實(shí)現(xiàn)較好的保留，易出現(xiàn)峰形差和拖尾等現(xiàn)象。因此實(shí)驗(yàn)考察了Phenomenex Kinetex C18（2．1 mm×150 mm，2．6μm）和Agilent Poroshell 120 SB－Aq（4．6 mm × 100 mm，2．7μm）2種液相色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，采用Agilent Poroshell 120 SB－Aq（4．6 mm×100 mm，2．7μm）柱的分析保留時(shí)間以及峰高、峰寬等參數(shù)均較優(yōu)，且峰形和拖尾現(xiàn)象也有明顯改善。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Agilent Poroshell 120 SB－Aq（4．6 mm ×100 mm，2．7μm）作為液相色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化分別比較了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相有機(jī)相的分離效果，發(fā)現(xiàn)采用甲醇和水作為流動(dòng)相時(shí)，丙烯酰胺的響應(yīng)高于乙腈和水。此外，還考察了水和甲醇（9∶1）、甲酸水溶液和甲醇（9∶1）作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度、保留時(shí)間、回收率和精密度的影響。結(jié)果顯示，采用水和甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，4%乙酸基質(zhì)中丙烯酰胺儀器響應(yīng)的精密度（n=6）較差。當(dāng)在水相中加入0．1%甲酸后，精密度得到明顯改善，因此實(shí)驗(yàn)選擇0．1%甲酸水溶液－甲醇（9∶1）為流動(dòng)相。

2.1.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化丙烯酰胺具有氨基與不飽和雙鍵，采用ESI正離子掃描模式的響應(yīng)優(yōu)于負(fù)離子模式。經(jīng)過(guò)方法參數(shù)優(yōu)化，丙烯酰胺的母離子m/z為72．1，碎裂電壓為40 V，特征子離子的m/z分別為55和44，碰撞能量分別為10 eV和12 eV。優(yōu)化條件下，10μg/L丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在代表性食品模擬物（4%乙酸）中的MRM色譜圖（m/z72．1/55）如圖1所示。

圖1 4%乙酸中丙烯酰胺的MRM色譜圖Fig．1 MRM chromatogram of acrylamide in 4% acetic acid

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是被測(cè)樣品中除目標(biāo)分析物以外的組分對(duì)目標(biāo)物定性、定量分析產(chǎn)生的干擾和影響[24]。為評(píng)估本方法的可靠性和準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線與溶劑校準(zhǔn)曲線的線性方程斜率比（Slope ratio，SR）評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[25]。當(dāng)SR=1，表明無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)SR＞1或SR＜1時(shí)，說(shuō)明存在基質(zhì)干擾和影響。

分別用4%乙酸（AcOH）、10%乙醇（EtOH）、20%乙醇、50%乙醇和橄欖油5種食品模擬物對(duì)丙烯酰胺陰性樣品進(jìn)行遷移試驗(yàn)，獲得的遷移試驗(yàn)溶液按照“1．3．2”方法制備基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，得到擬合線性方程的斜率K1。同法制備溶劑校準(zhǔn)曲線，得到擬合線性方程的斜率K2，則SR=K1/K2。結(jié)果顯示，水溶性食品模擬物的SR均接近1（0．983～1．01），表明基質(zhì)影響較?。挥托允称纺M物的SR為0．839，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，本研究采用在空白橄欖油中加入不同體積的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到一系列質(zhì)量濃度的油性食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照油性食品模擬物試液的制備方法對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行液液萃取，得到的水溶液經(jīng)上機(jī)測(cè)試，獲得擬合線性方程的斜率K2’，則油性食品模擬物的SR=0．974，說(shuō)明本方法的基質(zhì)效應(yīng)影響較小，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限在4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇和橄欖油中分別添加不同體積的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按照“1．3．2”制備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)試，分別以基線噪音的3倍（3S/N）和10倍（10S/N）儀器響應(yīng)所對(duì)應(yīng)的丙烯酰胺質(zhì)量濃度作為儀器檢出限和定量下限，從而計(jì)算方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。以食品模擬物中丙烯酰胺的質(zhì)量濃度或含量（x，μg/L或μg/kg）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。遷移量計(jì)算參考GB 5009．156－2016的相關(guān)規(guī)定，結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)顯示，不同食品模擬物中丙烯酰胺的含量與響應(yīng)值均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0．999。油性食品模擬物中丙烯酰胺的檢出限和定量下限分別為5．0μg/kg和10．0μg/kg，水溶性食品模擬物的檢出限和定量下限分別為1．0μg/L和5．0μg/L，說(shuō)明該方法靈敏度較高。

表1 本方法的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 1 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients，LOD and LOQ of the method

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，分別在不同空白食品模擬物中添加10、50、100μg/kg 3個(gè)水平的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)濃度分別制備6個(gè)平行樣，計(jì)算其平均回收率和精密度，精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示（見(jiàn)表2）。由表2可見(jiàn)，在3個(gè)加標(biāo)水平下，丙烯酰胺在不同食品模擬物中的平均回收率為90．0%～113%，RSD為0．40%～4．6%，說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表2 不同食品模擬物中丙烯酰胺的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs of acrylamide in different food simulants（n=6）

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)采集20批紙制食品接觸材料樣品，根據(jù)實(shí)際使用情況選擇合適的食品模擬物進(jìn)行遷移試驗(yàn)（依據(jù)GB 31604．1－2015[22]和GB 5009．156－2016[23]），所得溶液采用本方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，有2批紙吸管檢出丙烯酰胺，其遷移量分別為13．2、80．7μg/kg，其余18批樣品均未檢出。按紙制食品接觸材料的材質(zhì)類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可知，單一材質(zhì)的紙吸管的陽(yáng)性檢出率高于塑料淋膜類紙制品和紙基復(fù)合包裝材料（見(jiàn)表3）。

表3 不同材質(zhì)中丙烯酰胺遷移量的檢出率分析Table 3 Analysis of the detection rates of acrylamide migration in different paper-based materials

3 結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了紙制食品接觸材料中丙烯酰胺遷移量的測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，在不同食品模擬物中具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。水溶性食品模擬物中丙烯酰胺的檢出限為1．0μg/L，定量下限為5．0μg/L；油性食品模擬物（橄欖油）的檢出限為5．0μg/kg，定量下限為10．0μg/kg，完全滿足我國(guó)法規(guī)限量要求。實(shí)際樣品測(cè)試發(fā)現(xiàn)，紙吸管作為單一材質(zhì)的紙制食品接觸材料存在丙烯酰胺遷移風(fēng)險(xiǎn)和食品安全隱患。本研究所建立的測(cè)定方法適用于紙制食品接觸材料中丙烯酰胺遷移量的定性和定量分析，能為檢測(cè)機(jī)構(gòu)和相關(guān)監(jiān)管部門(mén)評(píng)估紙制食品接觸材料中丙烯酰胺遷移的合規(guī)性和風(fēng)險(xiǎn)性提供技術(shù)支持，為廣大消費(fèi)者的健康保駕護(hù)航。