高效液相色譜法測(cè)定穿梅三黃散中黃芩苷的含量

方忠意，劉素梅，劉占通，邱天寶，韓 立，王軍紅

（河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

穿梅三黃散收載于《中國(guó)獸藥典》2020年版二部中，是由大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅五味藥材經(jīng)粉碎、過(guò)篩和混勻制備而成的中獸藥散劑，主要用于治療水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性敗血癥、腸炎、爛鰓與赤皮?。?-2］。黃芩苷屬黃酮類(lèi)化合物，對(duì)多種病毒、真菌、細(xì)菌具有抑制作用［3-5］，常用其含量作為評(píng)價(jià)黃芩及其制劑質(zhì)量的一種手段。目前，《中國(guó)獸藥典》中穿梅三黃散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有顯微和薄層鑒別檢驗(yàn)，缺少含量測(cè)定的方法和指標(biāo)。該研究參考了部分文獻(xiàn)［6-7］，建立了黃芩苷含量測(cè)定的高效液相色譜法，可以更加精準(zhǔn)地評(píng)價(jià)穿梅三黃散質(zhì)量，為獸藥生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了參考手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器設(shè)備

Waters高效液相色譜系統(tǒng)：包含2695分析系統(tǒng)、2487紫外檢測(cè)器、Empower2色譜工作站；MILIPORE超純水處理器；METTLERXP205電子天平。

1.1.2 試藥試劑

黃芩苷對(duì)照品來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)為Z01271705，含量以96.8%計(jì)；穿梅三黃散樣品為實(shí)驗(yàn)室自制（大黃25g、黃芩15g、黃柏5g、穿心蓮2.5g、烏梅2.5g，粉碎，過(guò)篩，混勻即得）；穿梅三黃散陰性對(duì)照樣品為實(shí)驗(yàn)室自制（大黃25g、黃柏15g、穿心蓮2.5g、烏梅2.5g，粉碎，過(guò)篩，混勻即得）；乙腈、甲醇為色譜純?cè)噭?，試?yàn)中使用的水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件的選擇

參考相關(guān)有關(guān)文獻(xiàn)，通過(guò)比較不同色譜洗脫條件，以樣品中黃芩苷色譜峰的峰形是否對(duì)稱(chēng)、有無(wú)雜質(zhì)干擾為原則，確定色譜條件為：XBridgeC18（5μm，4.6mm×150mm）色譜柱，柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（22∶78），檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，進(jìn)樣量為10μl。

1.2.2 樣品溶液的制備

1.2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品0.15g，置100ml容量瓶中，加70%乙醇至近刻度，超聲處理30min，放至室溫，加70%乙醇稀釋至刻度，混勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜即得。

1.2.2.2 陰性對(duì)照樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取陰性對(duì)照樣品0.11g，置100ml容量瓶中，加70%乙醇至近刻度，超聲處理30min，放至室溫，加70%乙醇稀釋至刻度，混勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜即得。

1.2.2.3 提取方法的考察 精密稱(chēng)取穿梅三黃散供試品0.15g，共8份，置于100ml量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，分別超聲10、20、30、40min，每種超聲時(shí)間做2份平行，提取液分別進(jìn)樣。通過(guò)比較穿梅三黃散供試品中黃芩苷的含量，考察不同時(shí)間提取效果。結(jié)果表明，不同超聲時(shí)間提取效果差別不大，但還是以超聲提取30min提取效果最好。

1.2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)定黃芩苷對(duì)照品10mg，置于100ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷對(duì)照品貯備液；分別精密量取黃芩苷對(duì)照品貯備液適量，加70%乙醇，配制成濃度為2、4、10、20、50、100μg/ml的系列對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)高效液相色譜儀。記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

1.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份穿梅三黃散陰性對(duì)照樣品0.11g，分別精密加入6mg黃芩苷對(duì)照品，按1.2.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算黃芩苷含量及RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見(jiàn)，該方法準(zhǔn)確性好，可以很好地對(duì)黃芩苷進(jìn)行定量測(cè)定。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品，共6份，按照1.2.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算黃芩苷含量及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

1.2.6 耐用性試驗(yàn)

采用XBridgeC18（5μm，4.6mm×150mm）色譜柱，柱溫為30℃，取同一份供試品溶液，分別用乙腈-0.2%磷酸（76∶24）、乙腈-0.2%磷酸（78∶22）、乙腈-0.2%磷酸（80∶20）為流動(dòng)相進(jìn)行采樣，得到不同比例條件下的色譜圖。在3個(gè)不同比例的流動(dòng)相條件下，黃芩苷的色譜峰均能與雜質(zhì)峰完全分離，滿(mǎn)足不同的需求。

1.2.7 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取陰性對(duì)照樣品0.11g，按1.2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，之后按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2至圖5。

圖2 黃芩苷對(duì)照品色譜圖

圖3 陰?性對(duì)照樣品色譜圖

圖4 陰性對(duì)照樣品添加黃芩苷色譜圖

圖5 穿梅三黃散供試品色譜圖

由圖可知，在選定的色譜條件下，黃芩苷色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，且在對(duì)照品色譜峰的相應(yīng)位置上陰性對(duì)照樣品無(wú)色譜峰，說(shuō)明供試品溶液中無(wú)其他成分對(duì)黃芩苷的測(cè)定造成干擾，方法專(zhuān)屬性良好。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)研究建立了測(cè)定穿梅三黃散中的黃芩苷含量的高效液相色譜法，提取方法簡(jiǎn)便、回收率高、定量準(zhǔn)確，可以用于穿梅三黃散中黃芩苷含量的精準(zhǔn)測(cè)定。

該試驗(yàn)中采用70%乙醇并結(jié)合超聲波提取的方法，是基于提取試劑經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、容易獲得、試驗(yàn)方法便于推廣使用的原則，并不說(shuō)明這種方法是提取黃芩苷最高產(chǎn)出率的方法，因此按該試驗(yàn)方法測(cè)定穿梅三黃散中黃芩苷含量，也不表示是該獸藥制劑中黃芩苷絕對(duì)含量。