基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

伍謹(jǐn)林， 楊 柱,2， 龍奉璽,2， 吳文宇， 姚 琦， 楊 兵， 劉 薰， 唐東昕,2*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州省中醫(yī)腫瘤傳承與科技創(chuàng)新人才基地，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

結(jié)直腸癌作為最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在近年來(lái)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在2018年癌癥新發(fā)病率和死亡率中，結(jié)直腸癌排在第三位[1]。治療上主要有手術(shù)、放化療、靶向治療及生物免疫治療等手段，但副作用明顯。中醫(yī)藥作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)重要的組成部分，在聯(lián)合手術(shù)、放化療治療時(shí)，具有增效減毒，改善免疫力，提高生活質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)效益比的優(yōu)勢(shì)，對(duì)結(jié)直腸癌的輔助治療日益受到重視[2]。

在中醫(yī)學(xué)中，結(jié)直腸癌歸為“腸積”“鎖肛痔”等范疇，外感邪毒或飲食失調(diào)，脾胃濕熱蘊(yùn)結(jié)，下注腸道，灼血為瘀，熱盛成毒，日久發(fā)為腸癌，可見腹痛腹脹，里急后重，下利膿血粘液便等證，可予以白頭翁湯進(jìn)行治療。白頭翁湯主要由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味中藥組成，首見于張仲景《傷寒論》有“熱利下重者，白頭翁湯主之”[3-5]。方中白頭翁清熱涼血解毒；黃連瀉火解毒，黃柏清利下焦?jié)駸?；秦皮清熱解毒兼具收澀作用?/p>

白頭翁湯藥物化學(xué)成分較為復(fù)雜，現(xiàn)代藥理研究顯示[6]其具有抑菌、殺菌、抗炎、抗氧化損傷、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)胃腸道黏膜、改善心血管功能等作用。白頭翁湯可以通過阻止腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)分化及凋亡、抑制細(xì)胞增殖等[7-9]機(jī)制治療結(jié)直腸癌，緩解患者臨床癥狀[10]?；蜓芯拷M學(xué)證實(shí)[11]白頭翁湯可影響直腸癌患者細(xì)胞內(nèi)一系列基因的表達(dá)，它們主要富集在STAT、MAPK等信號(hào)傳導(dǎo)通路，可能與其抗腫瘤效果相關(guān)。但對(duì)白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)及多向藥理學(xué)的新型結(jié)合體，尤其適用于中藥這類具有明確功效，但藥理機(jī)制不甚清楚，并需要進(jìn)行深入挖掘的藥物分析。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的藥物成分、靶點(diǎn)、分子機(jī)制、信號(hào)通路等，構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行剖析，為深入探討白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制提供科學(xué)、有效的客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://omim.org/)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)、Cytoscape 3.7.1軟件、R語(yǔ)言軟件。

1.2 有效成分篩選 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)找到白頭翁湯4種藥材所含的266種成分，其中白頭翁57種，黃柏140種，黃連48種，秦皮21種。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出活性較高的成分共48種，見表1。

表1 白頭翁湯活性成分

1.3 治療結(jié)直腸癌潛在效應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的Related Targets、Targets Infomation對(duì)有效成分進(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)英文全名通過perl軟件與從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)編輯所得的uniprot.tsv文件相關(guān)聯(lián)，通過映射找到潛在靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的官方名稱(offical symbol)，在篩除重復(fù)的靶點(diǎn)后共得到181個(gè)潛在靶點(diǎn)。

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中的Gene map網(wǎng)站，輸入結(jié)直腸癌的英文名稱“colorectal cancer”，獲取結(jié)直腸癌相關(guān)疾病靶點(diǎn)，因疾病靶點(diǎn)較多，設(shè)置條件為Relevance score≥1對(duì)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出的結(jié)果進(jìn)行篩選，以增強(qiáng)疾病靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)性，將篩選出的結(jié)果與Gene map網(wǎng)站結(jié)果合并，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得結(jié)直腸癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)6 574個(gè)。

將有效成分相應(yīng)靶點(diǎn)及結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)相互映射，所得共有靶點(diǎn)即為治療結(jié)直腸癌的潛在效應(yīng)靶點(diǎn)，共153個(gè)，對(duì)應(yīng)白頭翁湯中33種活性成分，見表2。

表2 白頭翁湯活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因

2 潛在效應(yīng)基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及基因富集分析

2.1 疾病-藥物化學(xué)成分-潛在效應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建 將活性成分、治療結(jié)直腸癌潛在效應(yīng)靶點(diǎn)等信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，制成疾病-藥物化學(xué)成分-潛在效應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，發(fā)現(xiàn)共有188個(gè)節(jié)點(diǎn)，包含1個(gè)(圓形節(jié)點(diǎn))白頭翁湯、1類(六邊形節(jié)點(diǎn))疾病結(jié)直腸癌、33個(gè)(菱形節(jié)點(diǎn))活性成分、153個(gè)(長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn))潛在效應(yīng)靶點(diǎn)，585條邊代表了白頭翁湯、活性成分、潛在效應(yīng)靶點(diǎn)及結(jié)直腸癌對(duì)應(yīng)關(guān)系，見圖1。應(yīng)用Cytoscape-Tool-Network Analyzer分析節(jié)點(diǎn)的度值及介數(shù)值，計(jì)算出平均度值為13.09，平均介數(shù)值為0.011 7，槲皮素(degree為126)、異鼠李素(degree為22)、β-谷甾醇(degree為22)排在活性成分前三位，另外黃連素雖然度值較小(degree為11)，但具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[12-14]，故考慮四者作為白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的主要成分。

圖1 疾病-藥物化學(xué)成分-潛在效應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.2 潛在效應(yīng)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將所得潛在效應(yīng)靶點(diǎn)互作信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件制作PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖，共153個(gè)靶點(diǎn)，2 527條邊，節(jié)點(diǎn)大小及顏色變化反應(yīng)節(jié)點(diǎn)度值情況，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中平均度值為33，平均介數(shù)值為0.005 9，網(wǎng)絡(luò)中有58個(gè)靶點(diǎn)超過度值均值，AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、JUN、EGFR、MYC、ERBB2、STAT1等靶點(diǎn)為白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵潛在效應(yīng)靶點(diǎn)，與基因研究組學(xué)報(bào)告的基因差異表達(dá)結(jié)果[11]一致。

圖2 潛在效應(yīng)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.3 GO功能富集分析 通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在效應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，共得到1 166個(gè)條目，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選后得到318個(gè)，其中與生物過程相關(guān)條目291個(gè)，涉及細(xì)胞增殖、凋亡、生物合成、信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、激素水平、RNA及DNA代謝、免疫調(diào)節(jié)、機(jī)體發(fā)育等；與分子功能相關(guān)條目15個(gè)，涉及核受體活性、類固醇激素受體活性、胺受體活性、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、脂質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等；與細(xì)胞構(gòu)成相關(guān)條目12個(gè)，涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、囊泡、微粒、細(xì)胞外區(qū)域等，將GO分析中結(jié)果靠前的條目進(jìn)行柱狀圖分析，并對(duì)生物過程、細(xì)胞構(gòu)成、分子功能排名前十的結(jié)果進(jìn)行可視化分析，見圖3。

圖3 GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集及治療機(jī)制分析

2.4.1 KEGG通路富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在效應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，在PPI網(wǎng)絡(luò)中共有153個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，在通路富集分析時(shí)利用了81.6%，即124個(gè)，共找到相關(guān)信號(hào)通路56條，依據(jù)FDR值<0.05進(jìn)行篩選，得到18條相關(guān)通路，包括癌癥傳導(dǎo)途徑、膀胱癌通路、前列腺癌通路、非小細(xì)胞肺癌通路、胰腺癌通路、小細(xì)胞肺癌通路、結(jié)直腸癌通路、慢性粒細(xì)胞白血病、膠質(zhì)瘤通路、子宮內(nèi)膜癌通路、Toll樣受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、FAK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路、NOD樣受體信號(hào)通路，見圖4。排除8條惡性腫瘤通路，剩余10條通路可能是治療結(jié)直腸癌的主要途徑，即結(jié)直腸癌通路、癌癥傳導(dǎo)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、FAK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路、NOD樣受體信號(hào)通路。

圖4 KEGG通路富集分析

2.4.2 白頭翁湯治療結(jié)直腸癌機(jī)制分析 將10條通路與其對(duì)應(yīng)的70個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值調(diào)整節(jié)點(diǎn)大小，見圖5，可知靶點(diǎn)間度值的平均值為2.37，AKT1、MAPK1、JUN、RAF1、GSK3B、RELA、CHUK、CASP8、CASP9、NFKBIA、MAPK14、BAX、CCND1、PRKCB、PRKCA、EGFR、BCL2、CASP3、FOS、IL1β、VEGFA、CDKN1A、IL6、MYC、EGF、ERBB2的度值超過平均值，與STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶點(diǎn)間PPI互作關(guān)系得出的結(jié)論基本一致。白頭翁湯治療結(jié)直腸癌可能通過4個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)，即腫瘤代謝途徑、炎癥途徑、細(xì)胞凋亡途徑、血管生成途徑，其中結(jié)直腸癌通路、癌癥傳導(dǎo)通路與腫瘤代謝途徑關(guān)系密切，Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、FAK信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路與炎癥途徑相關(guān)，p53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路、FAK信號(hào)通路可與細(xì)胞凋亡途徑相連接，VEGF信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、FAK信號(hào)通路與血管生成途徑相關(guān)。在核心靶點(diǎn)中，AKT1、IL1β、Bax、VEGFA在Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖中的度值均超過平均值。PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的重要信號(hào)通路，其激活不僅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且介導(dǎo)糖酵解的發(fā)生，可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的異常生長(zhǎng)、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[15]，Akt1靶點(diǎn)與白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的腫瘤代謝途徑、細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)性較大；Toll樣受體信號(hào)通路激活來(lái)源于胞漿Toll/IL-1的結(jié)構(gòu)域，可能誘發(fā)炎癥，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、免疫逃逸、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[16]，IL-1β與白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的炎癥途徑相關(guān)性較大；Bax基因是人體最主要的凋亡基因，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，Bax/Bcl-2比例與結(jié)直腸癌的細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)[17]，與白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)性較大；VEGFA是作用最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子之一，能特異性刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與血管生成[18]，在結(jié)直腸癌中可對(duì)微血管形成起誘導(dǎo)作用，Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的T細(xì)胞因子可激活其表達(dá)，促進(jìn)腸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[19]，與白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的血管新生途徑相關(guān)性大。

圖5 白頭翁湯治療結(jié)直腸癌信號(hào)通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3 結(jié)果驗(yàn)證

3.1 材料

3.1.1 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(上海奧陸生物科技有限公司,編號(hào)20180619-446W)，常規(guī)消化傳代保存處理。

3.1.2 動(dòng)物 BALB/c雄性3周齡裸鼠，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002。

3.1.3 試劑與藥物 白頭翁湯組方藥材白頭翁15 g、黃連 6 g、黃柏 12 g、秦皮12 g(華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)1706002w)。1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)8119346)；DMSO試劑(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1213C0214)；PBS試劑(批號(hào)0043019)、10%FBS(批號(hào)1928700)、青鏈霉素(批號(hào)1914361)，北京沃比森科技有限公司；RIPA 裂解液(批號(hào)100117171213)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號(hào)010317170103)、HE染色試劑盒(貨號(hào)C0105)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Rabbit anti-Akt1 antibody(北京博奧森生物有限公司，批號(hào)bs-0115R)；Rabbit anti-VEGFA antibody(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)19003-1-AP)、Rabbit anti-IL-1β antibody(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab9722)；Bax Rabbit PolyAb(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)50599-2-lg)；Rabbit anti-GAPDH antibody(杭州賢至生物科技有限公司，批號(hào)AB-P-R001)。

3.1.4 儀器 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(美國(guó)Cole Partner公司)；LB943多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)Berthold Technologies公司)；低溫高速離心機(jī)(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司)；TB-215D電子天平(美國(guó)丹佛公司)；SIM-F140AY65-PC型雪花制冰機(jī)(日本松下公司)；MLTRAGEMK2超純水系統(tǒng)(英國(guó)ELGA公司)；垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；脫色搖床(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；SW-CJ-2陽(yáng)型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；RM 2235型組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；YT-7F型攤烤片機(jī)(湖南亞光科技有限公司)。

3.2 方法

3.2.1 分組、造模及給藥 將BALB/c裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯低劑量組，每組6只，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480按照8×107/mL密度皮下注射(空白對(duì)照組除外)，注射量0.2 mL，觀察成瘤情況，注射7 d后發(fā)現(xiàn)全部成瘤，注射14 d后對(duì)裸鼠進(jìn)行灌胃，白頭翁湯高、低劑量組給藥量分別為6.82、3.41 g/kg[20]，溶于0.2 mL生理鹽水進(jìn)行灌胃，每天1次，連續(xù)14 d，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組予以等量生理鹽水灌胃。

3.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

3.2.2.1 轉(zhuǎn)移瘤體積 灌胃14 d后，對(duì)各組BALB/c裸鼠右側(cè)腋下正常組織及轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行取材，計(jì)算瘤體積，公式為瘤體積=ab2/2，其中a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑。

3.2.2.2 腋下正常組織及瘤體HE染色 空白對(duì)照組選取1只裸鼠右側(cè)腋下正常組織，其余3組各選取1只裸鼠右側(cè)腋下瘤體，進(jìn)行HE染色。將組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，70%乙醇組織脫水24 h，80%乙醇組織脫水24 h，95%乙醇組織脫水12 h，無(wú)水乙醇脫水2 h，浸蠟3 h后包埋組織，待其充分冷卻后取出石蠟塊，并進(jìn)行修塊等處理，連續(xù)切片(厚度4 μm)，在30%乙醇浸沾后放入40 ℃水浴鍋中充分展開，用載玻片小心將組織緊貼于玻片上，烤片機(jī)上烘烤3 h，置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各脫蠟10 min，浸入無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，依次放入95%乙醇、80%乙醇各3 min，蒸餾水沖洗切片2 min，放入蘇木素中染核10 min，自來(lái)水沖洗15 min，蒸餾水清洗20 s，0.5%伊紅染色5 s，蒸餾水洗凈，80%乙醇浸泡2 min，95%乙醇浸泡3 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浸泡各5 min，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

3.2.2.3 Western blot檢測(cè)Akt1、IL-1β、Bax、VEGFA蛋白表達(dá) 稱取組織適量，通過RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA工作液測(cè)定待測(cè)樣品蛋白濃度，在煮沸變性、低溫離心后取10 μg上清液上樣，經(jīng)蛋白垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗及二抗等步驟后顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中成像拍照，測(cè)定各蛋白條帶的灰度值。

3.3 結(jié)果

3.3.1 轉(zhuǎn)移瘤體積 與模型對(duì)照組比較，白頭翁湯組轉(zhuǎn)移瘤體積有不同程度的減小，以高劑量組更明顯(P<0.05)，見表3。

表3 各組裸鼠轉(zhuǎn)移瘤體積

3.3.2 HE染色 空白對(duì)照組局部可見正常淋巴細(xì)胞以及結(jié)締組織，未見明顯結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)改變及腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組鏡下可見周圍腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，出現(xiàn)病理性核分裂，有腺樣結(jié)構(gòu)形成；白頭翁湯高劑量組鏡下見周圍殘存的淋巴細(xì)胞，局部仍可見異常增生細(xì)胞；白頭翁湯低劑量組見細(xì)胞異型明顯，核染色質(zhì)致密，伴見周圍區(qū)域有局部壞死，見圖6。

圖6 各組裸鼠病理組織HE染色(×40，100 μm)

3.3.3 Akt1、IL-1β、Bax、VEGFA蛋白表達(dá) 與模型對(duì)照組比較，白頭翁湯高劑量組Akt1、IL-1β、VEGFA蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、白頭翁湯組Bax表達(dá)降低，但模型對(duì)照組與白頭翁湯高劑量組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見圖7。

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05。

4 討論

本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，初步解析、挖掘白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。GO功能富集分析顯示，核堿基、核苷、苷酸和核酸代謝過程的正調(diào)節(jié)，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等生物過程與腫瘤物質(zhì)能量調(diào)控相關(guān)；炎癥反應(yīng)、對(duì)糖皮質(zhì)激素刺激的反應(yīng)等涉及炎癥的調(diào)控；細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)等過程與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖相關(guān)；血管發(fā)育、脈管系統(tǒng)發(fā)育等影響腫瘤新生血管形成。以上生物過程及細(xì)胞調(diào)節(jié)涉及復(fù)雜的分子功能，一方面說(shuō)明結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜、易變性，另一方面，也體現(xiàn)中藥治療中多成分、多靶點(diǎn)特性，說(shuō)明白頭翁湯能夠從不同角度、多管齊下對(duì)干預(yù)結(jié)直腸癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。

KEGG信號(hào)通路富集分析顯示，白頭翁湯治療結(jié)直腸癌的信號(hào)通路主要與腫瘤代謝途徑、血管生成途徑、細(xì)胞凋亡途徑及炎癥途徑相關(guān)，具體涉及到以上10條與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性較大的信號(hào)通路。Akt1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在腫瘤細(xì)胞的能量代謝及凋亡中起關(guān)鍵作用，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)[21]。PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，研究發(fā)現(xiàn)通過直接使人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的Akt1基因失活，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，但當(dāng)生長(zhǎng)因子受限并影響實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，敲除Akt1將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著下降[22]。IL-1β是炎性因子IL-1的亞型之一，屬于多效性促炎癥細(xì)胞因子類，在惡性腫瘤的免疫微環(huán)境中起重要作用，主要由巨噬細(xì)胞分泌，作為Toll信號(hào)通路的上游細(xì)胞因子，可激活Toll信號(hào)通路促進(jìn)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[23]，也可通過誘導(dǎo)如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、VEGF、炎癥趨化因子等多種腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞因子表達(dá)而促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[24]。Bax是Bcl-2家族成員中含有多BH結(jié)構(gòu)域的多功能蛋白，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，Bcl-2/Bax的比值可以反映細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，當(dāng)其比值上升，Bcl-2與Bax可形成異源二聚體抑制腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生[25]。VEGF信號(hào)通路對(duì)腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移方面起誘導(dǎo)作用，與結(jié)直腸腫瘤血管新生、浸潤(rùn)生長(zhǎng)有關(guān)鍵作用[26]，目前臨床廣泛使用的靶向藥物貝伐單抗，能夠與VEGFA結(jié)合，阻止腫瘤新生血管的形成，起到較為明顯的抗腫瘤作用[27]。

在4個(gè)主要化學(xué)成分中，槲皮素是一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤特性的植物類黃酮，其作用于結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞可引起B(yǎng)ax、p53表達(dá)上調(diào)，抑制Bcl-2基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[28],作用于HT-29細(xì)胞也可導(dǎo)致抑癌基因p53表達(dá)增強(qiáng)引起細(xì)胞凋亡,抑制腸癌細(xì)胞的增殖[29]。異鼠李素具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)磷酸化、降低VEGF活性、減少Bcl-2蛋白水平進(jìn)而活化caspase-3, 實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖的作用[30]。β-谷甾醇是白頭翁的主要化學(xué)成分，研究發(fā)現(xiàn)[31]β-谷甾醇能夠清除活性氧誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并抑制β-catenin及PCNA抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。黃連素是黃連抗腫瘤的主要化學(xué)成分，具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性[32-33]，并能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15，HT29等的凋亡，抑制腫瘤增殖[34-35]。這與本研究中分析結(jié)果基本一致，考慮白頭翁湯治療結(jié)直腸癌主要通過腫瘤代謝途徑、血管生成途徑、細(xì)胞凋亡途徑及炎癥途徑等多途徑實(shí)現(xiàn)。

在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，部分指標(biāo)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究預(yù)測(cè)結(jié)果不相符，在白頭翁湯治療小鼠右側(cè)腋下結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移瘤的Western blot檢測(cè)中，與模型對(duì)照組比較，對(duì)Bax蛋白表達(dá)水平影響不明顯，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析存在一定差異。推測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果未能驗(yàn)證預(yù)測(cè)的原因有以下幾點(diǎn)，(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本量有限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定偏倚，需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；(2)在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析過程中對(duì)靶點(diǎn)及通路的預(yù)測(cè)及相關(guān)性不夠精準(zhǔn)，可能與檢索數(shù)據(jù)庫(kù)不夠全面、篩選標(biāo)準(zhǔn)差異性等因素相關(guān)；(3)對(duì)于白頭翁湯中藥物含有的有效化學(xué)成分未定量分析，導(dǎo)致在治療腫瘤過程中療效產(chǎn)生差異；(4)在實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)過程中，操作和統(tǒng)計(jì)造成的誤差過大。

綜上，白頭翁湯可通過多途徑、多靶點(diǎn)治療結(jié)直腸癌，增加了白頭翁湯治療結(jié)直腸癌藥理作用的新認(rèn)識(shí)，也為相關(guān)研究提供新方向及新思路的理論及實(shí)踐參考。