過表達DcR3對肝癌細胞自噬功能的影響*

張玉達，彭 亮，趙靜靜

上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 201600

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。據統(tǒng)計，2018年肝癌的發(fā)病率在所有癌癥中排第6位，是全球第4大癌癥死亡原因，每年約有78.2萬人死于肝癌[1]。肝癌的臨床治療包括肝切除、肝移植、放化療等，治療效果差且易復發(fā)[2-3]，晚期肝癌患者5年生存率低于5%，預后極差。以中國為首的亞洲發(fā)展中國家是肝癌的高發(fā)地區(qū)[4]。肝癌嚴重威脅著人們的健康，明確其發(fā)病機制，有針對性地采取早期干預措施是當前研究的熱點。

前期研究發(fā)現，肝癌誘騙受體3(DcR3)的表達量越高，其對腫瘤細胞凋亡的抑制作用越顯著[5]。有研究發(fā)現，下調DcR3可以抑制肝癌細胞的侵襲性，增強腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)介導的細胞凋亡[6]。在先前的研究中發(fā)現，DcR3促進了細胞的增殖和遷移，抑制了細胞凋亡指標半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)和Bcl-2相關X(Bax)蛋白的表達[5]。自噬在真核細胞中廣泛存在，是一種基本生命現象，微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)和程序性死亡受體1(Beclin1)是自噬途徑的關鍵物質[7]。LC3B以LC3BⅠ和LC3BⅡ兩種形式存在并參與自噬，LC3BⅠ在正常情況下定位于細胞質,當自噬被誘導時，LC3B的細胞質形式LC3BⅠ通過與脂質分子磷脂酰乙醇胺(PE)結合轉化為LC3BⅡ，靶向定位于自噬體膜，介導自噬溶酶體的形成[8]。在細胞的生理過程中，自噬、凋亡、程序性壞死都是細胞的死亡形式，它們相互影響、相互調節(jié)，自噬可能在細胞死亡過程中扮演重要角色。本研究通過在肝癌細胞中過表達DcR3來觀察其對自噬功能的影響，為肝癌的早期診斷和預后判斷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1一般材料 人肝癌細胞株HepG2(北京中科質檢生物技術有限公司)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)液(DMEM)，胎牛血清，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；DcR3過表達慢病毒載體和空載慢病毒均購于上海吉凱基因化學技術有限公司；DcR3抗體、Beclin1抗體(Abcam 公司，美國)； LC3B抗體(美國Cell signaing公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗(美國sigma公司)；反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒。RT-PCR引物序列合成(上海生工生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞轉染 肝癌細胞株HepG2以每孔3×105個分布于六孔板，當細胞融合達到70%時，分別感染DcR3過表達慢病毒載體和空載慢病毒。對照組為LV-NC組(感染空載慢病毒)，實驗組為LV-DcR3組(感染DcR3過表達慢病毒載體)。以病毒滴度最小致死量(MIO)50 IU/mL加入病毒上清液(參照預實驗結果)。72 h 后收集LV-NC組和LV-DcR3 組細胞，然后進行相關實驗。

1.3.2免疫印跡試驗(Western blot) 用預冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗收集的細胞3次，然后用細胞裂解液(RIPA)裂解細胞，測定蛋白量，加入5×上樣緩沖液進行混勻，在100 ℃變性10 min，取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉膜，將硝酸纖維素膜置于含5%脫脂奶粉的緩沖液中封閉2 h，吸取干凈封閉液后加入一抗(均為1∶1 000)，4 ℃搖勻過夜。洗滌緩沖液(TBST)洗膜3遍，每次10 min，分別加入稀釋后的二抗IgG(1∶1 000)，室溫避光孵育2 h。孵育后TBST洗膜，電化學發(fā)光法(ECL)顯色蛋白條帶，然后進行凝膠成像分析，共進行平行實驗3次。

1.3.3RT-PCR Trizol法提取細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書將總RNA的1 μg mRNA反轉錄為cDNA，反轉錄條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。PCR擴增：95 ℃預變性30 s；94 ℃變性15 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴增40個循環(huán)。引物序列見表1?；贏BI7500平臺收集RT-PCR數據，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為對照，采用2-ΔΔCt計算相對表達水平。

表1 引物序列

2 結 果

2.1DcR3蛋白表達情況 本研究選擇DcR3表達較低且實驗常用的肝癌細胞株HepG2作為研究對象。DcR3過表達慢病毒載體轉染72 h后，用Western Blot驗證轉染情況。結果顯示，在相同印跡上以肌動蛋白B(ACTB)信號標準化成像條帶為標準，測定免疫印跡條帶的灰度值，LV-DcR3組DcR3蛋白的表達水平(1.88±0.15)明顯高于LV-NC組(0.74±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明DcR3慢病毒轉染效率達到實驗要求。見圖1。

圖1 不同病毒感染細胞組的蛋白表達水平

2.2過表達DcR3對肝癌細胞自噬相關基因mRNA的影響 肝癌細胞自噬相關蛋白LC3B和Beclin1的mRNA相對表達水平結果顯示，LV-DcR3組LC3B和Beclin1 mRNA相對表達水平與LV-NC組相比，明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Beclin1；B為LC3B。

2.3從蛋白相對表達水平觀察過表達DcR3對肝癌細胞自噬功能的影響 Western Blot結果顯示，在相同印跡上以ACTB信號標準化成像條帶為標準，與LV-NC組比較，LV-DcR3組LC3BⅡ/LC3BⅠ比例(1.65±0.15)、Beclin1蛋白相對表達水平(0.89±0.05)顯著低于LV-NC組(LC3BⅡ/LC3BⅠ比例為3.48±0.31、Beclin1蛋白相對表達水平為1.41±0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 過表達DcR3的肝癌細胞自噬蛋白的相對表達水平

3 討 論

DcR3是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFR)的成員之一，可與Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子配體相關分子1A(TLlA)競爭結合，從而阻斷以上配體誘導的凋亡[6]。有研究認為肝癌組織中DcR3的表達水平高于癌旁組織及正常組織，且與腫瘤分化、漿膜浸潤、肝外轉移相關[7]。然而，DcR3在肝癌進展和轉移中的確切機制仍不清楚。

近年來，自噬作為細胞死亡方式的一種，成為腫瘤研究的熱點。已有研究報道，自噬在促進腫瘤進展或抑制腫瘤轉化中發(fā)揮雙重作用，提示自噬缺陷誘發(fā)腫瘤是一種促癌機制[8]。有研究表明，自噬在肝臟疾病從慢性肝病發(fā)展為肝硬化，最終發(fā)展為肝癌的病理機制中起著重要的促死亡(促癌)作用[9]。Beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬途徑的關鍵物質[10]。筆者推測DcR3可能影響自噬的過程。本實驗通過在肝癌細胞中過表達DcR3以驗證此推測。

LC3B被認為是參與自噬的關鍵因素，是監(jiān)測自噬的特殊指標。本研究結果顯示，過表達DcR3時，LC3B蛋白和mRNA相對表達水平均降低。有研究表明,LC3B在腫瘤區(qū)較正常鄰近組織表達水平更低[11]，與本研究結果一致。此外，一篇Meta分析顯示，LC3B的表達水平與性別、年齡、腫瘤數量、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝硬化、TNM分期、甲胎蛋白、血管侵犯、組織學分級和肝功能無關(P>0.05)，而與總生存期有關(P<0.05)[12]。

Beclin1是首個被發(fā)現的哺乳動物自噬蛋白，在自噬活性中起著重要的調節(jié)作用，在小鼠肝癌模型中發(fā)現Beclin1發(fā)揮抑癌作用[13]。肝癌組織中Beclin1表達水平明顯低于癌旁組織，Beclin1表達水平與復發(fā)及生存率相關[14]。本研究結果顯示，DcR3過表達會抑制Beclin-1的表達。因此，這些結果表明，DcR3抑制了肝癌細胞中Beclin1和LC3B的表達，提示自噬可能受到DcR3的調控。

綜上所述，本研究通過體外實驗初步驗證了DcR3可以抑制自噬的發(fā)生，但由于是初步研究結果，LC3B和Beclin-1是否受DcR3調控，有待進一步研究證實。