并基角毛藻若干分類學(xué)疑問(wèn)的初步探討

陳作藝 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

并基角毛藻若干分類學(xué)疑問(wèn)的初步探討

陳作藝 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

并基角毛藻是硅藻門(mén)角毛藻屬的典型種類, 以“相鄰角毛基部并行融合”作為標(biāo)志性特征, 但該特征是否穩(wěn)定, 及如何賦予其分類學(xué)價(jià)值?尚存較多爭(zhēng)議。研究以符合現(xiàn)存并基角毛藻分類標(biāo)準(zhǔn)的藻株作為目標(biāo)藻株,采用毛細(xì)管顯微操作技術(shù)從我國(guó)沿海代表水域分離藻株, 建立了目標(biāo)藻株的單克隆培養(yǎng)株系, 利用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡分別對(duì)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察, 同時(shí)還擴(kuò)增了核糖體大亞基編碼基因的D1-D3區(qū)序列, 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。綜合分析形態(tài)學(xué)特征和分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù), 初步得到以下結(jié)論: (1)具有相同遺傳特征的并基角毛藻株系在“相鄰角毛基部并行融合”特征上具有不穩(wěn)定性, 即“相鄰角毛基部并行融合”不能作為并基角毛藻種類的標(biāo)志性特征; (2)并基角毛藻和洛氏角毛藻作為相似種類, 均顯示出較高的物種多樣性, 高于目前的認(rèn)知, 預(yù)示著或許存在隱形種或擬隱形種; (3)推測(cè)并基角毛藻單胞變型只是并基角毛藻原種的一個(gè)生活史階段, 是并基角毛藻的同種異名, 不宜繼續(xù)保留其獨(dú)立的分類學(xué)地位。

并基角毛藻; 分類學(xué); 角毛基部并行融合; 并基角毛藻單胞變型

角毛藻屬(Chaetoceros Ehrenberg)是物種多樣性最為豐富的浮游硅藻類群之一, 廣泛分布于全球各類水體中[1,2]。角毛藻屬的物種多樣性豐富, 目前已報(bào)道528個(gè)分類單元, 但其中有一半被認(rèn)為是同種異名[2—4], 僅有224個(gè)物種目前被認(rèn)可[5]。

并基角毛藻(C.decipiens Cleve)是角毛藻屬的典型種類, 最初報(bào)道于北大西洋海域[6]。該種具有規(guī)則的鏈狀群體和發(fā)達(dá)的角毛, 在光學(xué)顯微鏡下易于識(shí)別, 同時(shí), 它也是一個(gè)全球廣布種, 從極地到熱帶的各類海域中都有記錄[2,3,7—10]。

目前, 并基角毛藻的典型形態(tài)特征可概括為: (1) 鏈狀群體規(guī)則, 窗孔多為橢圓形; (2) 角毛長(zhǎng)且直, 位于同一平面上; (3) 角毛上具有4—6行交替縱向排列的孔紋和小刺; (4) 相鄰角毛的基部具有長(zhǎng)度不等的并行融合; (5) 尚未發(fā)現(xiàn)休眠孢子。其中第4個(gè)特征是并基角毛藻的命名依據(jù), 也被認(rèn)為是本種的標(biāo)志性特征而被廣泛應(yīng)用[2,3,9]。

然而, 也有一些學(xué)者對(duì)此提出疑問(wèn)。曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)“相鄰角毛基部并行融合”存在變化情況[3,4,7—9,11],有時(shí)長(zhǎng), 有時(shí)短。有學(xué)者甚至認(rèn)為具有“不同長(zhǎng)度并行融合”的種類或許是過(guò)渡種類, 或應(yīng)該是新的分類單位[3,8,11]。因此有學(xué)者建議尋找其他更為有效而穩(wěn)定的形態(tài)特征, 作為并基角毛藻的識(shí)別特征[3,10]。截至目前, 關(guān)于“相鄰角毛基部的并行融合”是否是穩(wěn)定的形態(tài)特征, 如何賦予其分類學(xué)價(jià)值仍未有定論。

另外, 在以往的研究中, 尤其是基于人工培養(yǎng)藻株的形態(tài)學(xué)研究中, 報(bào)道了為數(shù)不少的種下分類單位, 并基角毛藻單胞變型(C.decipiens f.singularis Gran)即是其中之一。這些種下分類單位的建立僅僅是在形態(tài)特征的基礎(chǔ)之上, 仍存在諸多爭(zhēng)議。并基角毛藻單胞變型的建立依據(jù)是“單細(xì)胞生活或形成2—4個(gè)細(xì)胞的短鏈”, 而非原種“形成長(zhǎng)的鏈狀群體”。有學(xué)者認(rèn)為該變型只是原種的某一個(gè)發(fā)育階段, 應(yīng)是同種異名[7,12,13], 但也有學(xué)者持不同觀點(diǎn),認(rèn)為群體特征亦可作為穩(wěn)定的區(qū)分依據(jù), 支持單胞變型的獨(dú)立存在[14,15]。為了驗(yàn)證單胞變型是否成立, 需開(kāi)展基于藻株生活史的連續(xù)觀察, 并開(kāi)展傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)之外的分析比較工作, 例如分子分類學(xué)技術(shù)的引入。

當(dāng)前, 傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的分析手段已成為藻類學(xué)研究的主流,并極大促進(jìn)了重要硅藻類群的分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)發(fā)展[16—22]。分子生物學(xué)技術(shù)可以為傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)研究提供有益的補(bǔ)充信息, 兩者的相互結(jié)合可增強(qiáng)結(jié)論的客觀性。本文研究正是基于建立的單克隆培養(yǎng)藻株, 結(jié)合生活史中形態(tài)特征的觀察, 以及基于目標(biāo)基因序列分析的分子數(shù)據(jù), 針對(duì)上述分類學(xué)疑問(wèn)開(kāi)展的二次研究, 以期能夠提供科學(xué)而客觀的答案。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選取我國(guó)沿海的代表性海域, 利用浮游植物網(wǎng)(孔徑20 μm)進(jìn)行水平拖網(wǎng), 以采集活體浮游植物樣品, 盡快帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行目標(biāo)藻株的分離、純化。以前言中概括的典型形態(tài)特征作為判斷并基角毛藻的關(guān)鍵依據(jù), 進(jìn)而建立目標(biāo)藻株的培養(yǎng)體系。需要說(shuō)明的是, 鑒于“相鄰角毛基部的并行融合”的相關(guān)爭(zhēng)議, 相鄰角毛基部具有或無(wú)并行融合的藻株均作為目標(biāo)藻株。另外, 針對(duì)單細(xì)胞或2—4個(gè)短鏈群體, 亦作為目標(biāo)藻株, 以分析并基角毛藻單胞變型的分類學(xué)地位。

1.2 單克隆培養(yǎng)株系的建立

首先利用毛細(xì)管法在生物倒置顯微鏡(Mshot MI-12)下挑取目標(biāo)藻細(xì)胞, 轉(zhuǎn)移至滴有L培養(yǎng)液的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中[23], 待其存活并繁殖達(dá)到一定細(xì)胞數(shù)量(100個(gè)以上), 轉(zhuǎn)移到盛有L培養(yǎng)液的100 mL三角瓶中培養(yǎng)。單克隆藻株保存于光照培養(yǎng)室內(nèi),培養(yǎng)條件是(22±2)℃、12鯰12光循環(huán)、光照強(qiáng)度約為50—80 μmol photons/(m2·s)。本文共建立了25個(gè)目標(biāo)藻株的單克隆培養(yǎng)株系(表 1)。

在目標(biāo)藻株中, 藻株MC1035的初始分離細(xì)胞是多細(xì)胞鏈狀群體, 但是在該藻株后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中, 同時(shí)出現(xiàn)了群體細(xì)胞和單個(gè)細(xì)胞2種生活形態(tài),于是對(duì)MC1035進(jìn)行2次分離, 將群體細(xì)胞和單個(gè)細(xì)胞分別挑出、純化, 建立單克隆培養(yǎng), 然后再分別編號(hào), 群體細(xì)胞的株系繼續(xù)編為MC1035, 單個(gè)細(xì)胞的株系則編為MC1036。

1.3 休眠孢子的誘導(dǎo)

表 1 本文建立的目標(biāo)藻株信息Tab.1 List and information of monoclonal strains in this study

分別吸取1 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)藻液, 轉(zhuǎn)移到盛有L無(wú)氮培養(yǎng)液的100 mL三角瓶中培養(yǎng)[10],培養(yǎng)條件是(22±2)℃、12鯰12光循環(huán)、光照強(qiáng)度約為50—80 μmol photons/(m2·s), 而培養(yǎng)時(shí)間至少為兩周以上, 以誘導(dǎo)目標(biāo)藻株的休眠孢子, 每個(gè)藻株均誘導(dǎo)3次以上, 并定期觀察有無(wú)休眠孢子產(chǎn)生。

1.4 形態(tài)學(xué)特征的觀察

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液, 置于光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53)下進(jìn)行微分干涉(Differential interference contrast, DIC)觀察, 并使用Olympus DP27數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。目標(biāo)藻株的群體類型、色素特征、窗孔特征、角毛形態(tài)及走勢(shì)、休眠孢子在母細(xì)胞內(nèi)的位置及其外形等主要基于光鏡照片。

對(duì)于掃描電鏡樣品的處理, 先取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液約200 μL, 加入等體積的濃硫酸(>95%), 靜置10min, 以去除有機(jī)質(zhì), 然后加入滅菌雙蒸水多次水洗至中性[24]。用20 mL注射器吸取酸化后的樣品,用孔徑5 μm的Milipore膜過(guò)濾樣品, 然后取出膜, 并待其自然晾干后, 用碳導(dǎo)電膠貼于銅臺(tái)上, 噴金并置于掃描電鏡(Zeiss Utras 55)下觀察和拍照。角毛上孔紋和刺的特征、角毛基部融合的特征、窗孔超微特征、唇形突結(jié)構(gòu)、休眠孢子結(jié)構(gòu)等主要基于掃描電鏡的觀察。

對(duì)于透射電鏡樣品的處理, 酸化方法同上?？捎靡埔簶屛?0 μL酸化后的樣品, 滴加在噴鍍碳膜的微孔銅網(wǎng)上, 自然晾干后置于透射電鏡(Philips Tecnai 10)下觀察和拍照。殼面和殼套孔紋等主要基于透射電鏡的觀察。

1.5 基于LSU nrDNA部分序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析

用離心法收集藻細(xì)胞, 進(jìn)行總DNA的提取[19]。利用正向引物D1R-F[25]和反向引物D3B-R[26]擴(kuò)增核糖體大亞基編碼基因(LSU nrDNA)的D1-D3區(qū)序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 首先94℃預(yù)變性4min, 接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94℃ 35s, 55℃ 50s, 72℃ 35s), 最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物送往深圳華大基因公司(BGI)進(jìn)行純化和測(cè)序。

利用NCBI的blast功能, 檢索目標(biāo)藻株序列的鄰近序列信息, 同時(shí)檢索NCBI現(xiàn)有的并基角毛藻序列, 以及洛氏角毛藻C.lorenzianus Grunow等相似種類的序列(表 2)。運(yùn)用BioEdit軟件進(jìn)行序列的比對(duì)和矩陣[27], 有741個(gè)堿基用于最終的分析。基于MrModeltest 2.3[28]計(jì)算, 選擇的最適模型和參數(shù)為GTR+I+G, ([AC=0.6762], [AG=1.7054], [AT= 0.8081], [CG]=0.1322, [CT]=3.8583, [GT]=1.0000, gamma shape=0.6573, nucleotide frequencies: A=0.2603, C=0.1869, G=0.2922, T=0.2605), 然后分別用RAxML-HPC2[29]和MrBayes 3.2[30]構(gòu)建最大似然樹(shù)(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯推理樹(shù)(Bayesian inference, BI)。其中ML分析的自檢值(Bootstrap test)設(shè)定為1000。選用大西洋角毛藻C.atlanticus Cleve (EF423454)為群外對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 基于形態(tài)特征的初步鑒定

如“材料與方法”中所述, 本文以并基角毛藻作為目標(biāo)藻, 以現(xiàn)存的并基角毛藻形態(tài)分類特征為判斷依據(jù), 建立了25個(gè)目標(biāo)藻的單克隆培養(yǎng)體系。也就是說(shuō), 這25個(gè)目標(biāo)藻株均符合前言概括的關(guān)于并基角毛藻的前3個(gè)特征, 但在第4個(gè)特征“相鄰角毛基部的并行融合”上, 則存在變化, 或長(zhǎng)、或短、甚至無(wú)。

除了上述概括的共有特征之外, 目標(biāo)藻株之間也存在一些區(qū)別特征。后續(xù)利用光學(xué)顯微鏡(LM)和電子顯微鏡(EM)對(duì)25個(gè)目標(biāo)藻株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察, 并依據(jù)群體特征、相鄰角毛基部融合特征、角毛孔紋特征等將目標(biāo)藻株進(jìn)行了類群劃分,主要可劃分為以下4個(gè)類群。

表 2 本文選用的GenBank序列信息Tab.2 Information of sequences from GenBank used in this study

類群一: 包括株系MC737、MC765、MC1025、MC1036和MC1040。LM下, 它們均符合并基角毛藻單胞變型的定義: 單細(xì)胞生活, 或由2—4個(gè)細(xì)胞組成短鏈, 這5個(gè)株系的初始分離細(xì)胞亦是單個(gè)細(xì)胞。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的殼面長(zhǎng)軸34.24—52.59 μm, 貫殼軸高6.78—25.63 μm, 窗孔高6.91—14.46 μm。角毛上的孔紋橢圓形, 密度為10 μm內(nèi)18—23個(gè)?；谏鲜鲂螒B(tài)特征, 類群一的藻株初步鑒定為并基角毛藻單胞變型C.decipiens f.singularis。

類群二: 包括MC780、MC1024、MC1038、MC1109和MC1110。LM下, 由多數(shù)細(xì)胞形成長(zhǎng)鏈狀群體, 相鄰角毛基部具有并行融合的特征。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的殼面長(zhǎng)軸29.64—54.18 μm, 貫殼軸高9.88—15.42 μm, 窗孔高4.43—12.74 μm。角毛上的孔紋橢圓形, 密度為10 μm內(nèi)16—24個(gè)。類群二的藻株初步鑒定為并基角毛藻C.decipiens。

類群三: 包括MC705、MC708、MC731、MC773和MC1018。LM下, 由多數(shù)細(xì)胞形成長(zhǎng)鏈狀群體, 相鄰角毛基部不具有并行融合的特征。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的殼面長(zhǎng)軸27.04—50.11 μm, 貫殼軸高8.2—17.5 μm, 窗孔高5.86—15.14 μm。角毛上的孔紋橢圓形, 密度為10 μm內(nèi)14—18個(gè)。類群三的藻株初步鑒定為形似并基角毛藻C.cf.decipiens。

類群四: 包括MC675、MC682、MC703、MC704、MC709、MC710、MC772、MC1007、MC1035和MC1058。LM下, 由多數(shù)細(xì)胞形成長(zhǎng)鏈狀群體, 相鄰角毛基部不具有并行融合的特征。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的殼面長(zhǎng)28.32—48.64 μm, 貫殼軸高10.78—18.33 μm, 窗孔高5.93—14.52 μm。角毛上的孔紋橢圓形, 密度為10 μm內(nèi)19—25個(gè)。類群四的藻株初步鑒定為形似并基角毛藻C.cf.decipiens。

類群四與類群三的藻株在形態(tài)學(xué)上更為相似,其相鄰角毛的基部均不具有并行融合, 兩者之間的區(qū)別主要在于角毛孔紋密度, 類群三(10 μm內(nèi)14—18個(gè))低于類群四(10 μm內(nèi)20—25個(gè))。在以往報(bào)道中, 并基角毛藻的相似種是洛氏角毛藻C.lorenzianus Grunow, 兩者之間的有效區(qū)分依據(jù)正是角毛孔紋的疏密程度[2,6,9,10,31], 因此本文亦將角毛孔紋特征作為二次分析的目標(biāo)特征, 以判斷角毛孔紋密度的分類學(xué)意義。

2.2 基于LSU nrDNA部分序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析

整理并基角毛藻及其鄰近種類的LSU nrDNA D1-D3序列, 得到40個(gè)序列信息, 其中25個(gè)目標(biāo)藻株來(lái)自本文新獲得的序列信息, 另外15個(gè)為NCBI下載的鄰近序列和外類群序列。對(duì)矩陣后的序列信息進(jìn)行了最大似然法分析和貝葉斯推理, 以大西洋角毛藻(EF423454)為外類群, 分別構(gòu)建了ML和BI系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。兩者具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),繼而將兩者合并(圖 1)。

圖 1顯示, 無(wú)論是本文的25個(gè)目標(biāo)藻株, 還是NCBI下載的并基角毛藻和洛氏角毛藻, 都很好地聚類在一個(gè)大的分支上, 并具有很高的置信值(BPP=1, ML=100), 說(shuō)明基于現(xiàn)存形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)而鑒定的并基角毛藻和洛氏角毛藻具有很好的遺傳一致性, 分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)論也支持它們的單起源。

在并基角毛藻和洛氏角毛藻共同構(gòu)成的大分支中, 最先分離出來(lái)的是巴拿馬海灣(Gulf of Panama)的形似洛氏角毛藻(EF423437), 構(gòu)成分支Ⅰ, 且具有較高的置信值(BPP=1, ML=100)。其次分離出來(lái)的是加拿大芬迪灣(Fundy Bay)的形似并基角毛藻(KC986068), 構(gòu)成分支Ⅱ, 也具有較高的置信值(BPP=1, ML=100)。再向內(nèi), 來(lái)自意大利那不勒斯灣(Gulf of Naples)的3株洛氏角毛藻(EF423434、EF423435、EF423436)聚為一個(gè)小的分支, 構(gòu)成分支Ⅲ, 置信值也較高(BPP=0.99, ML=97)。本文建立的25個(gè)目標(biāo)藻株與一株分離自波福特海(Beaufort Sea)的并基角毛藻(JQ995413)聚為一支, 構(gòu)成分支Ⅳ。

2.3 結(jié)合形態(tài)特征與分子系統(tǒng)的物種確認(rèn)

分子系統(tǒng)樹(shù)(圖 1)明確顯示, 本文從中國(guó)沿海建立的25個(gè)單克隆培養(yǎng)株系具有完全相同的LSU nrDNA D1—D3序列, 它們應(yīng)該屬于同一物種。

首先, 鑒于類群二(MC780、MC1024、MC1038、MC1109和MC1110)具有典型的“相鄰角毛基部的并行融合”, 經(jīng)與并基角毛藻模式標(biāo)本手繪圖對(duì)比(Cleve 1873, p.11, Pl.I, fig 5a & b), 可以確認(rèn)類群二的藻株是典型的并基角毛藻。

其次, 類群一(MC737、MC765、MC1025、MC1036和MC1040)的藻株雖然多為單細(xì)胞或2—4個(gè)細(xì)胞的短鏈群體, 且沒(méi)有“相鄰角毛基部的并行融合”, 但它們與類群二藻株具有相同的LSU nrDNA D1—D3序列, 也應(yīng)該是并基角毛藻, 同時(shí)也說(shuō)明單細(xì)胞或2—4個(gè)細(xì)胞的短鏈群體只是生活史的一個(gè)階段, 并基角毛藻單胞變型應(yīng)該是并基角毛藻的同種異名。

最后, 類群三和類群四的藻株雖然都不具有“相鄰角毛基部的并行融合”, 但同樣基于相同的LSU nrDNA D1—D3序列信息, 它們也應(yīng)該是并基角毛藻, 證實(shí)了“相鄰角毛基部的并行融合”并非穩(wěn)定特征。另外, 也說(shuō)明本文統(tǒng)計(jì)的角毛孔紋密度范圍(類群三, 10 μm內(nèi)14—18個(gè); 類群四, 10 μm內(nèi)19—25個(gè))均在并基角毛藻的尺度區(qū)間之內(nèi)。

另外, 從NCBI下載的鄰近序列也表現(xiàn)出一定的形態(tài)學(xué)差異和遺傳多樣性, 這些將在討論部分,加以詳細(xì)分析。

圖 1 基于核糖體大亞基LSU nrDNA部分序列的系統(tǒng)樹(shù)(以大西洋角毛藻為群外對(duì)照)Fig.1 Molecular phylogenetic tree inferred from LSU rDNA, with C.atlanticus as outgroup

2.4 形態(tài)學(xué)描述

并基角毛藻(圖版Ⅰ)

Chaetoceros decipiens Cleve, Bihang till K Svenska Vet-Akad Handlingar 1:11, Pl.I, fig.5a & b, 1873。

細(xì)胞鏈直或略微彎曲, 常形成4—10個(gè)細(xì)胞的鏈狀群體(圖版Ⅰ-1—4), 也有單細(xì)胞生活, 或2—4個(gè)細(xì)胞短鏈的情況(圖版Ⅰ-5—6)。細(xì)胞寬環(huán)面觀呈矩形, 殼面長(zhǎng)軸多大于貫殼軸高度(圖版Ⅰ-1—6)。每個(gè)細(xì)胞含多個(gè)色素體, 色素體呈小盤(pán)狀,散布(圖版Ⅰ-1、2、4—5)。殼面觀呈寬橢圓形或近圓形, 中央?yún)^(qū)域略高(圖版Ⅰ-9、14), 使得殼面呈馬鞍形。殼面中央有一個(gè)環(huán)紋, 環(huán)紋周?chē)胁灰?guī)則放射狀排列的肋紋, 肋紋之間散布有數(shù)量眾多的小孔(圖版Ⅰ-15—16)。殼面邊緣有圓弧形硅質(zhì)肋(圖版Ⅰ-9、14)。殼面長(zhǎng)軸兩端有明顯隆起, 上生角毛。殼套高度約占貫殼軸的1/3(圖版Ⅰ-2、4), 分布有平行狀排列的硅質(zhì)條紋, 條紋間散布有小孔(圖版Ⅰ-17)。鏈端殼面近中央位置有一個(gè)唇形突,外管較短(圖版Ⅰ-14—15), 鏈中殼面則無(wú)唇形突(圖版Ⅰ-16)。相鄰角毛基部與殼面長(zhǎng)軸相接處有若干條硅質(zhì)脊和硅質(zhì)膜(圖版Ⅰ-10)。殼套上結(jié)構(gòu)與殼面相同, 有平行排列的肋紋, 以及其間分布的孔紋。殼套基部有一圈凹槽(圖版Ⅰ-17)。相鄰細(xì)胞之間的窗孔呈橢圓形(圖版Ⅰ-1—4、6、9), 中央平, 或有略微縊縮(圖版Ⅰ-6、9)。

角毛硬且直, 與鏈軸方向平行, 呈Brunel-I型,即角毛均分布在同一個(gè)平面上(圖版Ⅰ-7)。角毛自殼面長(zhǎng)軸兩端生出后, 即與相鄰角毛交叉。鏈中殼面的相鄰角毛基部有并行融合(圖版Ⅰ-1、2、7、10), 融合區(qū)域或長(zhǎng)或短(圖版Ⅰ-1、7), 有時(shí)甚至無(wú)(圖版Ⅰ-3、4、6、9)。鏈端角毛呈U型(圖版Ⅰ-3、5、6、8), 比鏈中角毛稍粗。角毛上分布有4—6排交替縱向排列的孔紋和小刺, 孔紋呈橢圓形(圖版Ⅰ-12—13), 長(zhǎng)0.25—0.59 μm [(0.37±0.07) μm],密度為13—25/10 μm [(20.44±3.48/10) μm], 有時(shí)光鏡下可見(jiàn)(圖版Ⅰ-11)。環(huán)帶多數(shù), 環(huán)帶分布有平行排列的肋紋, 其間散布一些小孔(圖版Ⅰ-18)。

營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的殼面長(zhǎng)軸27.09—54.18 μm [(43.46±10.22) μm], 貫殼軸高6.83—25.46 μm [(14.31±2.78) μm], 窗孔高4.41—15.12 μm [(9.35±2.26) μm](n=50)。

未見(jiàn)休眠孢子。

分布: 采自中國(guó)的青島、寧波、柘林灣、萬(wàn)山島、香港、大亞灣及湛江海域。本種還分布于北大西洋和戴維斯海峽[6,32], 北美西部沿岸海域[7], 美國(guó)羅德島州納拉干塞特灣[3], 加利福尼亞灣及下加利福尼亞灣海岸[9]; 南墨西哥灣[35], 丹麥沿海[4], 日本海[33], 意大利那不勒斯灣[10]。

3 討論

3.1 并基角毛藻的分類學(xué)二次研究和信息補(bǔ)充

自1873年首次報(bào)道以來(lái), “相鄰角毛基部的并行融合”即被作為并基角毛藻的標(biāo)志性特征, 尤其是在模式標(biāo)本的手繪圖中, “并行融合”這一特征顯著可見(jiàn)[6]。在此后的研究中, 雖有學(xué)者報(bào)道“角毛基部并行融合”的長(zhǎng)度存在變化情況[3,4,7—9,11], 但質(zhì)疑多集中在具有過(guò)渡特征的種類是不是新的種類?以及“不具有并行融合”的種類是并基角毛藻還是洛氏角毛藻?因?yàn)椤安⑿腥诤稀痹徽J(rèn)可作為這兩個(gè)種的區(qū)別特征[2,3,9]。但是對(duì)于具有“并行融合”即可確認(rèn)是并基角毛藻的觀點(diǎn), 并未有學(xué)者產(chǎn)生懷疑,這一觀點(diǎn)在模式種手繪圖中即有體現(xiàn), 在后續(xù)的研究中也被驗(yàn)證[2,3,9]。

因此, 本研究首先要解決的問(wèn)題, 即是確認(rèn)具有典型特征的并基角毛藻。本研究的類群二具有典型的“相鄰角毛基部的并行融合”(圖版Ⅰ-1、2、7、10), 經(jīng)與并基角毛藻模式標(biāo)本手繪圖對(duì)比[6], 可以確認(rèn)類群二的藻株是典型的并基角毛藻。

在此基礎(chǔ)上, 通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)的分析, 發(fā)現(xiàn)不具有“并行融合”特征的類群三、類群四藻株與類群二藻株呈現(xiàn)出極為保守的遺傳多樣性, 同時(shí)除了“并行融合”特征之外, 它們?cè)谄渌螒B(tài)特征上也表現(xiàn)出較高的一致性。因此, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù), 我們可以認(rèn)為類群三、類群四藻株也是并基角毛藻。繼而可以確認(rèn)“相鄰角毛基部的并行融合”特征并非穩(wěn)定特征, 以往研究中賦予其重要的分類學(xué)權(quán)重是不妥的, 尤其是作為并基角毛藻的標(biāo)志性特征?；诖? 我們認(rèn)為并基角毛藻具有一定的形態(tài)變化范圍, 尤其是“相鄰角毛基部的并行融合”特征, 時(shí)長(zhǎng)時(shí)短, 甚至有時(shí)無(wú), 這是對(duì)并基角毛藻分類學(xué)信息的最新補(bǔ)充。綜上所述, “相鄰角毛基部的并行融合”特征仍可作為并基角毛藻的特征之一, 需要補(bǔ)充說(shuō)明的是, 這一特征并非持續(xù)特征,沒(méi)有“并行融合”特征的也可能是并基角毛藻。

3.2 并基角毛藻與并基角毛藻單胞變型

并基角毛藻單胞變型由Gran[34]于1904年首次提出, 主要特征是細(xì)胞單個(gè)生活或組成2—4個(gè)細(xì)胞的短鏈, 這一觀點(diǎn)被之后的部分學(xué)者認(rèn)同和采用[9,14,15]。但也有學(xué)者認(rèn)為本變型是原種的同種異名[12,13], Cupp[7]也不認(rèn)同本變型的獨(dú)立分類學(xué)地位,指出本變型可能為原種的一個(gè)發(fā)育階段或從原種的小孢子發(fā)育而來(lái)。

本研究建立了單細(xì)胞或短鏈群體的單克隆培養(yǎng)株系(類群一), 并將其與典型并基角毛藻進(jìn)行了對(duì)比分析。首先, 發(fā)現(xiàn)它們?cè)谛螒B(tài)特征上具有較高的一致性。除了群體的長(zhǎng)短之外, 并未發(fā)現(xiàn)其他形態(tài)差異, 只是單細(xì)胞或短鏈群體不具有“相鄰角毛基部的并行融合”特征, 如前所述, 這一特征并不穩(wěn)定, 不應(yīng)作為分類學(xué)特征。其次, 我們對(duì)類群一藻株的生活史進(jìn)行了跟蹤觀察, 發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過(guò)程中,會(huì)有長(zhǎng)的鏈狀群體出現(xiàn), 表明不同的群體特征可能是處于不同生活史階段。本研究中MC1035和MC1036即是從同一培養(yǎng)株系中二次分離出來(lái)的,但它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)和遺傳特征上均表現(xiàn)出較高的保守型, 說(shuō)明它們應(yīng)該是同一物種, 也說(shuō)明群體特征并不能作為重要的分類學(xué)依據(jù)。最后, 具有不同群體特征的藻株(類群一、類群二、類群三、類群四)均具有完全相同的LSU nrDNA D1—D3序列信息, 遺傳多樣性上極為保守, 說(shuō)明它們是同一物種。綜上所述, 本研究認(rèn)為并基角毛藻單胞變型應(yīng)該是并基角毛藻的同種異名, 不應(yīng)具有獨(dú)立的分類學(xué)地位。

3.3 并基角毛藻與洛氏角毛藻的遺傳多樣性

如前所述, “相鄰角毛基部的并行融合”并非穩(wěn)定特征, 沒(méi)有“并行融合”特征的也可能是并基角毛藻。這也帶來(lái)了新的問(wèn)題。因?yàn)樵谝酝芯恐?“相鄰角毛基部的并行融合”被作為并基角毛藻和洛氏角毛藻的區(qū)別性特征[2,3,9]。如果不具有“并行融合”特征的藻株也可能是并基角毛藻的話, 那么它與洛氏角毛藻的有效區(qū)別特征又是什么呢?曾有學(xué)者認(rèn)為殼面是否具有孔紋可以作為兩者的區(qū)別特征[8,11], 也有學(xué)者認(rèn)為休眠孢子可以作為區(qū)別特征[3,9]。目前都難有確定的結(jié)論, 因?yàn)槲覀兪紫刃枰_認(rèn)洛氏角毛藻模式標(biāo)本的特征, 繼而獲得活體藻株, 并建立形態(tài)數(shù)據(jù)和分子信息, 這些都還需要后續(xù)深入研究。

然而, 分子系統(tǒng)樹(shù)(圖 1)也提供了一些有價(jià)值的信息, 為后續(xù)研究指出了方向。從NCBI下載的鄰近序列表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性, 例如都被鑒定為并基角毛藻的加拿大芬迪灣株系(KC986068)與本文建立的25個(gè)株系, 以及波福特海株系(JQ995413)之間具有明顯的遺傳差異; 同樣被鑒定為洛氏角毛藻的那不勒斯灣株系(EF423434、EF423435、EF423436), 與巴拿馬株系(EF423437)也具有較明顯的遺傳差異。這說(shuō)明基于現(xiàn)存形態(tài)分類學(xué)體系確立的并基角毛藻和洛氏角毛藻可能存在較大的不確定性, 某些重要的分類學(xué)特征或許并不具有真實(shí)的分類學(xué)價(jià)值, 前面已論述的“相鄰角毛基部的并行融合”就是其中代表。另外, 這些遺傳差異的存在也表明并基角毛藻和洛氏角毛藻可能存在較高的物種多樣性, 只是目前還被隱藏在這兩個(gè)種類里面。其實(shí)在以往的形態(tài)學(xué)研究中, 已有較多的形態(tài)多樣性被報(bào)道, 例如殼面孔紋的有無(wú)、角毛孔紋的形態(tài)差異和密度區(qū)別, 還有休眠孢子的形態(tài)差異等等[4,8—11,33,35], 這些都預(yù)示著潛在的物種多樣性的存在。

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PRELIMINARY STUDY ON SOME TAXONOMIC PUZZLES OF CHAETOCEROS DECIPIENS CLEVE

CHEN Zuo-Yi and LI Yang
(Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

As one of the largest marine planktonic diatom genera, Chaetoceros Ehrenberg has a very wide biogeographical distribution from polar to tropical waters.C.decipiens Cleve is a representative species of the genus Chaetoceros characterized by the regular chains and stiff setae.The fusing part on the sibling setae bases was the unique characters for C.decipiens in the present taxonomy system that mainly built on morphology, which has been accepted and used by some diatom taxonomists.However, some other researchers hold different opinion, in which the fusing on the sibling setae bases was a variable morphological structure that could not give much significant taxonomic value.Meanwhile, some questions remain about the taxonomic position of the intraspecific units of C.decipiens, which is difficult to answer whether these intraspecific units are independent taxonomic units or just a living stage of life cycle of C.decipiens.To answer this question, the monoclonal stains and the combination of morphology features and molecular analy-sis will be required.To do this, several monoclonal strains were established from several Chinese representative sites using glass micropipette under invert microscopy according with the present taxonomic morphology of C.decipiens.The morphology was studied by light microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.Meanwhile, the hypervariable region (D1-D3) of nucleic large subunit ribosomal rRNA encoding gene was amplified and sequenced as molecular evidence.The result indicated that the fusing of sibling setae base was not a steady structure, which could not be considered as significant morphological feature for the accurate identification of C.decipiens, and that some similar species without fusing of sibling setae base could be the true C.decipiens.Moreover, according to the molecular phylogenetic analysis, high diversity was hidden in the morphologically-identified C.decipiens and C.lorenzianus, which might show the presence of cryptic and pseudo-cryptic species.Inaddition, C.decipiens f.singularis Gran was confirmed as a temporary stage of whole life cycle of C.decipiens based on the continuous observation during cultures maintainance.Finally, they totally shared the same LSU sequences.Thus, C.decipiens f.singularis Gran was proposed as the synonym of C.decipiens.

Chaetoceros decipiens; Taxonomy; Fusing of sibling setae base; C.decipiens f.singularis

Q949.27

A

1000-3207(2017)04-0914-09

圖版ⅠPlateⅠ

1—6并基角毛藻(LM): 1.細(xì)胞鏈寬環(huán)面觀 (MC1109); 2.鏈中角毛并行融合(箭型)(MC1110); 3.寬環(huán)面觀及U型端角毛(MC1035); 4.鏈中角毛無(wú)并行融合(箭型)(MC1058); 5.單細(xì)胞寬環(huán)面觀(MC1036); 6.短鏈群體寬環(huán)面觀(MC1036).標(biāo)尺=50 μm (1, 3), 25 μm (5, 6), 10 μm (2, 4); 7—18并基角毛藻(LM.11; SEM.7—10, 12—14; TEM.15—18).7.鏈狀群體, 示角毛基部并行融合(MC1109); 8.單細(xì)胞寬環(huán)面觀(MC765); 9.鏈中殼面及窗孔(MC765); 10.角毛基部并行融合(箭型), 硅質(zhì)翼(三角)及硅質(zhì)脊(箭頭)(MC1024); 11—13.角毛結(jié)構(gòu)(MC773); 14—15.鏈端殼面, 示唇形突(箭型)(MC731); 16.鏈中殼面, 示中央環(huán)紋(箭型)(MC731); 17.殼套(MC731); 18.環(huán)帶(MC731).標(biāo)尺=10 μm (7, 8, 11), 5 μm (16, 18), 4 μm (9, 14), 2 μm (13, 15), 1 μm (10, 12, 17)
1—6 LM of Chaetoceros decipiens.1.Broad girdle views (MC1109); 2.Fusing parts of sibling setae (arrows) (MC1110); 3.Broad girdle views and U-shaped terminal setae (MC1035); 4.Sibling setae base without fusing (arrows) (MC1058); 5.Solitary living cell (MC1036); 6.Short chain in broad girdle view (MC1036).7—18 Chaetoceros decipiens.LM (Fig.11), SEM (Figs 7—10, 12—14) and TEM (Figs 15—18).7.Chain in broad girdle view, with fusing at the sibling setae base (MC1109); 8.Solitary cell (MC1036); 9.Intercalary valves and aperture (MC765); 10.Detail of fusing setae base (arrow), silica wings (triangle) and silica ridges (arrowhead) (MC1024); 11—13.Structure of setae (MC773); 14—15.Terminal valves with rimoportulae (arrowheads) (MC731); 16.Intercalary valve with central annulus (arrow) (MC731); 17.Mantle (MC731); 18.Girdle bands (MC731).1, 3 scale bars, 50 μm.5, 6 scale bars, 25 μm.2, 4 scale bars, 10 μm.7, 8, 11 scale bars, 10 μm.16, 18 scale bars, 5 μm.9, 14 scale bars, 4 μm.13, 15 scale bars, 2 μm.10, 12, 17 scale bars, 1 μm

10.7541/2017.114

2016-07-04;

2016-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(31570205和31370235); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030401084)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31570205,31370235); Guangdong Province Science and Technology Program (2015A030401084)]

陳作藝(1988—), 男, 廣東肇慶人; 碩士研究生; 主要從事藻類學(xué)研究。E-mail: 875999102@qq.com

李揚(yáng), E-mail: liyang@scnu.edu.cn