劑量效應(yīng)對輸血相容性檢測影響研究①

何 屹 文 韜 袁 紅 （四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院輸血科，成都610072）

劑量效應(yīng)指紅細(xì)胞表面抗原與其特異性抗體的凝集程度與基因型密切相關(guān)，純合子與抗體的凝集性比雜合子強(qiáng)，這種因純合子、雜合子不同表現(xiàn)出紅細(xì)胞被凝集性有強(qiáng)弱之分的現(xiàn)象稱為劑量效應(yīng)。確定并排除血型意外抗體是保障輸血安全的重要措施。目前檢測意外抗體的手段主要是進(jìn)行抗體篩查和交叉配血，對抗體篩查陽性的患者，絕大多數(shù)醫(yī)院采取隨機(jī)選擇獻(xiàn)血員進(jìn)行配血，根據(jù)配血陰性結(jié)果選擇血液輸注的方式，簡稱“盲配”。但抗原抗體的凝集反應(yīng)可能受劑量效應(yīng)影響，反應(yīng)格局、凝集強(qiáng)度等不明確會(huì)存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)。因意外抗體漏檢導(dǎo)致的輸血反應(yīng)時(shí)有報(bào)道，對臨床輸血安全提出挑戰(zhàn)。為研究“劑量效應(yīng)”對相關(guān)檢測的影響，本文將四川省人民醫(yī)院2016 年8 月至2019 年5 月共383 例抗體篩查陽性標(biāo)本進(jìn)行研究，用臨床實(shí)例驗(yàn)證劑量效應(yīng)在輸血相容性檢測中的影響，現(xiàn)介紹如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取 2016 年 8 月至 2019 年 5 月在四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院進(jìn)行抗體鑒定且具備特異性血型抗體標(biāo)本。排除病例：①Lewis系統(tǒng)抗體；②Rh 系統(tǒng)抗D；③具有多種抗體的樣本。排除原因：由于實(shí)驗(yàn)室使用荷蘭Sanquin 試劑紅細(xì)胞組上Lewis 血型系統(tǒng)只有Lea 抗原或Leb 抗原，無同時(shí)具備Lea和Leb兩種抗原的試劑紅細(xì)胞，故抗Lewis 未納入統(tǒng)計(jì)，同理抗D 也未納入。為避免干擾，樣本中同時(shí)具備多種抗體的病例也未納入統(tǒng)計(jì)。排除后研究對象為383 個(gè)病例，其中男性患者106 例，女性患者 277 例，年齡 0~96 歲，平均年齡（49.8±18.7）歲。

1.1.2 主要試劑與儀器 意外抗體篩查細(xì)胞為江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；抗人球試劑、MNS 血型鑒定試劑、Rh 分型試劑為上海血液生物有限公司產(chǎn)品；抗體鑒定試劑紅細(xì)胞組、Kidd、Duffy 血型鑒定試劑、聚乙二醇（polyethlene glycol，PEG）試劑為荷蘭Sanquin 公司產(chǎn)品；LISS、微柱檢測卡為奧森多臨床診斷（英國）有限責(zé)任公司產(chǎn)品；所有試劑均在有效期內(nèi)按使用說明書操作。奧森多臨床診斷（英國）有限責(zé)任公司孵育器、卡式離心機(jī)；日本久保田KDC-2200低速離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 回顧性分析抗體篩查陽性標(biāo)本進(jìn)行抗體鑒定時(shí)，與含純合子、雜合子抗原的試劑紅細(xì)胞組反應(yīng)結(jié)果 將抗原抗體反應(yīng)分為3類：1為未發(fā)現(xiàn)劑量效應(yīng)：抗體與純合子、雜合子試劑紅細(xì)胞凝集強(qiáng)度無區(qū)別；2 為存在劑量效應(yīng)：抗體與純合子、雜合子試劑紅細(xì)胞均有凝集現(xiàn)象，但強(qiáng)度有區(qū)別；3 為存在劑量效應(yīng)：抗體只與純合子試劑紅細(xì)胞有反應(yīng)，與雜合子試劑紅細(xì)胞無反應(yīng)。

1.2.2 意外抗體鑒定方法 根據(jù)抗體性質(zhì)選用鹽水介質(zhì)試管法和微柱法（抗人球介質(zhì)）鑒定意外抗體。①鹽水介質(zhì)試管法：在一次性試管中分別加入待檢血漿（或血清）2滴，再加入相應(yīng)的3%抗體鑒定試劑紅細(xì)胞或自身紅細(xì)胞各1 滴并混勻，1 000 g 離心15 s。②微柱法（抗人球介質(zhì)）：使用Ortho BioVue Coombs檢測卡。向每個(gè)反應(yīng)柱內(nèi)加入50 μl Bliss液后，分別向反應(yīng)柱內(nèi)加入10 μl 3%抗體鑒定試劑紅細(xì)胞，最后向反應(yīng)柱內(nèi)加入40 μl 待檢血清或血漿。將卡于37℃孵育10 min，取出檢測卡放入BioVue離心機(jī)離心5 min，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 抗體效價(jià)測定 本研究僅對IgG 抗E 進(jìn)行了效價(jià)測定。將待檢血清（原液50 μl）倍比稀釋后，向試管內(nèi)加入50 μl 3%~5%的E 抗原為純合子的紅細(xì)胞混懸液，混勻，置于37℃孵育30 min 后用生理鹽水1 000 g 離心1 min，洗滌紅細(xì)胞3 次，洗滌后將紅細(xì)胞濃度配制為3%，加抗人球試劑1 滴，1 000 g離心15 s，以出現(xiàn)1+凝集反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為其抗體效價(jià)。

1.2.4 PEG 加強(qiáng) 抗E 與雜合子試劑紅細(xì)胞不反應(yīng)時(shí)，使用PEG 加強(qiáng)技術(shù)。在試管中加入待檢血漿（或血清）2 滴，各管內(nèi)分別加入3%E 抗原雜合子試劑紅細(xì)胞、自身紅細(xì)胞各1 滴并混勻，并做陰性對照。最后各管加入PEG 試劑4 滴，37℃水浴15 min后用生理鹽水在1 000 g下離心1 min，洗滌細(xì)胞3次，將洗滌后的細(xì)胞配制成3%濃度的懸液，取10 μl 加入Ortho BioVue Coombs 檢測卡，于專用卡式離心機(jī)離心5 min后記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)不同效價(jià)抗E 對E 抗原雜合子試劑細(xì)胞漏檢率。將抗E抗體效價(jià)進(jìn)行常用對數(shù)轉(zhuǎn)換，與漏檢率進(jìn)行線性相關(guān)分析。將抗體效價(jià)＜4計(jì)為低效價(jià)；抗體效價(jià)≥4計(jì)為高效價(jià)，對高、低效價(jià)兩組漏檢雜合子率行χ2檢驗(yàn)，分析差異性。相關(guān)性和差異性分析均使用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

2 結(jié)果

2.1 血型意外抗體與劑量效應(yīng) 通過對臨床標(biāo)本中意外抗體的鑒定，抗體與試劑紅細(xì)胞中純合子、雜合子的反應(yīng)情況結(jié)果顯示：MNS、Rh、Kidd、Duffy血型系統(tǒng)抗體均存在劑量效應(yīng)，但受影響程度存在一定差異，從MNS、Rh、Kidd、Duffy 血型系統(tǒng)依次遞減（表1）；抗人球介質(zhì)、鹽水介質(zhì)分別有318 例和65例抗體鑒定，MNS、Kidd血型系統(tǒng)IgM 抗體在鹽水介質(zhì)中同樣有類似以上表現(xiàn)（表2）；最受關(guān)注的意外抗體不與雜合子反應(yīng)率顯示，抗M 不與雜合子反應(yīng)比例最高，達(dá)19.05%，其余依次為抗E：7.14%，抗JKa、抗 JKb：3.70%（表 3）。結(jié)果提示 MNS、Rh 血型系統(tǒng)受劑量影響大。表1~3 也提示MNS、Rh、Kidd、Duffy血型系統(tǒng)均有一定比例的抗體沒有劑量效應(yīng)。

表1 微柱法中不同血型系統(tǒng)抗體劑量效應(yīng)分布［例（%）］Tab.1 Distribution of antibody dose effects of different blood groups in microcolumn method［n（%）］

表2 鹽水試管法中不同血型系統(tǒng)抗體劑量效應(yīng)分布情況［例（%）］Tab.2 Distribution of antibody dose effects of different blood groups in saline test tube method［n（%）］

表3 不同血型系統(tǒng)抗體劑量效應(yīng)分布［例（%）］Tab.3 Distribution of antibody dose effects in different blood group systems［n（%）］

2.2 抗E 抗體效價(jià)與劑量效應(yīng) 本研究以E 抗體為例，研究不同抗體效價(jià)與劑量效應(yīng)的關(guān)系。結(jié)果提示，效價(jià)1 時(shí)，雜合子對抗E 的漏檢率達(dá)66.67%，效價(jià)＜4時(shí)，雜合子對抗E的漏檢率達(dá)40%，抗E效價(jià)與漏檢率存在負(fù)相關(guān)（r=-0.799，P＜0.05，表4）。抗體效價(jià)＜4 與抗體效價(jià)≥4 兩組雜合子漏檢率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表5）。效價(jià)≤4 的抗E 有一定比例沒有劑量效應(yīng)。

表4 抗E不同效價(jià)與劑量效應(yīng)關(guān)系（例）Tab.4 Relationship between different titers and dose ef?fect of anti-E（n）

表5 不同效價(jià)抗E漏檢率Tab.5 Missed detection rate with different titers of anti-E

2.3 不與雜合子凝集的抗E 使用PEG 加強(qiáng) 將16 例不與雜合子凝集的抗E 使用PEG 加強(qiáng)與試劑紅細(xì)胞組反應(yīng)后（方法見1.2.4）均出現(xiàn)了凝集。有3 例發(fā)現(xiàn)E 抗原陰性試劑紅細(xì)胞出現(xiàn)弱凝集，但凝集強(qiáng)度明顯弱于E 抗原陽性的試劑紅細(xì)胞，該3 名血樣患者DAT 均為陽性。結(jié)果提示，使用PEG 加強(qiáng)可有效增加意外抗體與雜合子細(xì)胞的陽性率。

3 討論

劑量效應(yīng)現(xiàn)象是指1個(gè)控制某血型抗原的等位基因?yàn)榧兒献訒r(shí)，其紅細(xì)胞上的該抗原為相應(yīng)的“雙劑量”；當(dāng)?shù)任换驗(yàn)殡s合子時(shí)，其紅細(xì)胞上相應(yīng)抗原為“單劑量”［1］。紅細(xì)胞膜上的不同抗原劑量會(huì)對血清學(xué)結(jié)果產(chǎn)生影響，有些抗體與雙劑量抗原和單劑量抗原會(huì)呈現(xiàn)不同的強(qiáng)度差異，與雙劑量抗原紅細(xì)胞反應(yīng)較強(qiáng)，與單劑量抗原紅細(xì)胞反應(yīng)較弱［2］。

通過對383例抗篩陽性標(biāo)本中劑量效應(yīng)的分析發(fā)現(xiàn)，隨著抗體效價(jià)降低，劑量效應(yīng)導(dǎo)致雜合子抗原漏檢率越高；在效價(jià)＜4 時(shí)，雜合子抗原漏檢率明顯增高，此時(shí)抗E 對雜合子漏檢率高達(dá)40%。盡管抗體效價(jià)與劑量效應(yīng)的漏檢率存在負(fù)相關(guān)，但低效價(jià)的抗E 仍有無劑量效應(yīng)的情況，分析后認(rèn)為與抗體親和力有關(guān)。親和力高的抗體與純、雜合子抗原結(jié)合能力差異不大，親和力低的抗體反之。當(dāng)血清中高親和力抗體數(shù)量較少時(shí)，可以出現(xiàn)效價(jià)不高，但仍可與純、雜合子抗原細(xì)胞凝集的現(xiàn)象。低效價(jià)、低親和力抗體的劑量效應(yīng)對輸血安全的影響更大。

本研究采用臨床實(shí)例直接顯示了Rh、MNS、Kidd 血型均存在劑量效應(yīng)，且抗M 漏檢雜合子率高達(dá)19%，抗E 為6.7%，抗JKa、抗JKb為3.7%。許亞莉等［3］報(bào)道抗M、抗E 漏檢率高與抗M、抗E 是臨床發(fā)現(xiàn)頻率最高的意外抗體或抗體本身特點(diǎn)有關(guān)。這也與通過稀釋抗體來研究劑量效應(yīng)得出的結(jié)論一致［4-5］。此外李曉紅等［6］通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算得出，在試劑紅細(xì)胞組株數(shù)或者抗原陽性細(xì)胞株數(shù)較少時(shí)，劑量效應(yīng)可能對抗體鑒定結(jié)果造成錯(cuò)誤。本次研究中，鑒定效價(jià)＜4 的抗體時(shí)，僅與純合子細(xì)胞反應(yīng)的現(xiàn)象非常明顯，試劑紅細(xì)胞組純合子株數(shù)較少時(shí)，難以判斷抗體種類，需使用PEG、酶處理細(xì)胞等方法，同時(shí)應(yīng)全面了解患者免疫史、自身抗體情況、患者ABO 以外血型鑒定結(jié)果等，綜合分析后判斷。

目前，我國多數(shù)醫(yī)院抗體篩查發(fā)現(xiàn)意外抗體后，采用“盲配”方法，即隨機(jī)選擇獻(xiàn)血員進(jìn)行配血，根據(jù)配血陰性結(jié)果選擇血液輸注。但受劑量效應(yīng)影響，受血者意外抗體效價(jià)不高時(shí)，“盲配”相合的血液為假陰性概率較大。輸注不合血液后發(fā)生遲發(fā)血清學(xué)反應(yīng)與遲發(fā)性溶血反應(yīng)比例大致為64∶36，導(dǎo)致的紅細(xì)胞輸注無效及溶血反應(yīng)時(shí)有報(bào)道［7-10］。為避免劑量效應(yīng)帶來的危害，建議：①進(jìn)行抗體及相應(yīng)抗原的鑒定，建立更完善的輸血相容性檢測流程，即意外抗體篩查陽性，應(yīng)進(jìn)行抗體鑒定后使用相應(yīng)抗血清篩查獻(xiàn)血員抗原，選擇抗原陰性的血液進(jìn)行交叉配血并輸注；②抗體篩查時(shí)，如凝集強(qiáng)度≤2+，建議使用PEG 加強(qiáng)的方法對盲配陰性的結(jié)果進(jìn)行復(fù)查，可有效降低漏檢率。使用PEG 加強(qiáng)方法配血時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對照。需注意患者DAT陽性，存在弱自身抗體時(shí)，PEG 方法加強(qiáng)后可能配血結(jié)果陽性，需判斷是自身抗體還是同種抗體引起；③有條件的醫(yī)院建立抗體篩查陽性患者的血清學(xué)檔案，記錄患者意外抗體種類。在征得患者知情同意下，醫(yī)院間共享信息。減少因抗體隨時(shí)間衰減至檢測閾值之下或盲配帶來的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，抗體篩查陽性時(shí)，盲配不能有效避免抗體效價(jià)低時(shí)劑量效應(yīng)帶來的漏檢，應(yīng)采用更合理的輸血相容性檢測流程來確保輸血安全。