Treg/ Th17平衡與膿毒癥的關(guān)系研究進(jìn)展①

張改君 龍細(xì)雨 靳露露 賈建偉 郭麗穎 （天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津301600）

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）和輔助性T 細(xì)胞17（helper T cells Th17，Th17）同屬于 CD4+T細(xì)胞亞群，但兩者在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮不同作用。Treg 可分泌抑制炎癥的細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等，發(fā)揮免疫抑制作用；Th17 細(xì)胞可分泌促炎因子如IL-17、IL-21、IL-22 等，促進(jìn)炎癥進(jìn)展。Treg/Th17平衡在維持免疫耐受中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，Treg/Th17 失衡與自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥等疾病關(guān)系密切［1-3］。此外，Treg/Th17 平衡在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中具有重要調(diào)節(jié)作用。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、副作用小等優(yōu)勢(shì)，通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡在膿毒癥治療中具有重要參考意義。

1 Treg/Th17概述

1.1 Treg 分化 Treg 是 CD4+T 細(xì)胞亞型，主要在胸腺中產(chǎn)生，也可由外周誘導(dǎo)分化形成［4］。胸腺中nTreg在自身抗原、細(xì)胞因子和胸腺共刺激分子刺激下發(fā)育；外周pTreg在外周TGF-β作用下從幼稚T細(xì)胞分化而來。除CD4 和CD25 外，Treg 特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，且Foxp3對(duì)Treg生成不可或缺。無論是性聯(lián)免疫失調(diào)綜合征（IPEX）患者，F(xiàn)oxp3 功能缺失型基因突變小鼠scurfy，還是Foxp3 基因敲除小鼠，均證實(shí)Foxp3 缺失可導(dǎo)致nTreg 細(xì)胞生成障礙，從而使其他免疫細(xì)胞尤其是不表達(dá)Foxp3 的效應(yīng)CD4+T 細(xì)胞即CD4+CD25-T 細(xì)胞功能過強(qiáng)，導(dǎo)致消耗綜合征或免疫細(xì)胞增生性自身免疫?。?-6］。如通過逆轉(zhuǎn)錄病毒使CD4+CD25-T 細(xì)胞高表達(dá)Foxp3，可導(dǎo)致部分效應(yīng)CD4+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有抑制功能的Treg。此外，nTreg 細(xì)胞分化受T 細(xì)胞（抗原）受體（T cell receptor，TCR）信號(hào)影響，信號(hào)越強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，nTreg 細(xì)胞數(shù)越多［7］。初始 T 細(xì)胞可在外周經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá) Foxp3，向 iTreg 細(xì)胞分化［8］。如TGF-β 是iTreg 分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可通過Smad2/Samd3 磷酸化誘導(dǎo)Foxp3 表達(dá)，促進(jìn)iTreg增殖［9］。

Treg 可產(chǎn)生抗炎因子、耗盡關(guān)鍵生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)炎癥通路，發(fā)揮抗炎作用，維持自身免疫穩(wěn)態(tài)。Treg產(chǎn)生IL-10和TGF-β等抗炎因子，也可通過細(xì)胞接觸依賴方式分泌抗炎因子，抑制炎癥進(jìn)展［10-11］。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，Treg 可增加 IL-10、IL-4、TGF-β和 IL-2 表達(dá)，降低促炎因子 IL-17 和 IFN-γ 水平［12］?；罨母涡菭罴?xì)胞通過細(xì)胞接觸依賴方式促進(jìn)Treg增殖，增強(qiáng)Treg 抑制活性，可明顯減輕肝臟炎癥和損 傷［13］。 Treg 也 可 通 過 CTLA-4 接 觸 依 賴 下 調(diào)CD80/CD86 表達(dá)，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞表型和功能，發(fā)揮免疫抑制作用［14］。Treg 需依賴關(guān)鍵因子如IL-2等，促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Treg 分化，發(fā)揮免疫耐受作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷 IL-2 可顯著提高小鼠 IFN-γ和 IL-17A 表達(dá)，缺失 IL-2 可顯著減少 Treg 數(shù)［16］。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏持續(xù)的IL-2 信號(hào)刺激可減弱 Treg 的抑制功能［17］。調(diào)節(jié)炎癥通路也是 Treg 維持自身穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。研究報(bào)道，Treg 可通過調(diào)節(jié) NF-kB 通路維持自身穩(wěn)態(tài)［18］。此外，Treg 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路激活減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血引發(fā)的腦炎［19］。

1.2 Th17 細(xì)胞分化 Th17 細(xì)胞是 CD4+T 細(xì)胞的另一個(gè)亞型，主要分泌促炎因子IL-17、IL-21、IL-22等，在炎癥進(jìn)展中起重要作用［20-22］。TGF-β 在炎癥細(xì)胞因子（如IL-6或IL-21）刺激下，通過維甲酸受體相關(guān)孤核受體 γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor γt，RORγt）途徑參與Th17 細(xì)胞分化過程［23］。RORγt 是Th17 細(xì)胞分化和發(fā)揮功能必要的轉(zhuǎn)錄因子。體外在IL-6和TGF-β極化條件下刺激野生型或RORγt缺陷小鼠來源的CD4+CD25-CD62L+CD44-T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型CD4+T 細(xì)胞IL-17 產(chǎn)生明顯增加，而Rorγ-/-小鼠（缺乏Rorγ和Rorγt）CD4+T細(xì)胞在體外極化后 IL-17 細(xì)胞顯著減少［24］。RORγt 在促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化同時(shí)，抑制T 細(xì)胞分泌IL-10，導(dǎo)致Th17 細(xì)胞致病性［25］。此外，TCR 與信號(hào)傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在維持Th17 細(xì)胞致病性方面發(fā)揮重要作用［26］。

TGF-β 在誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用。TGF-β1 缺陷小鼠在所有組織部位的Th17 細(xì)胞顯著減少［27］。盡管 IL-21 通過 SMAD4 誘導(dǎo) Th17 細(xì)胞分化，但其作用發(fā)揮依賴于TGF-β，T細(xì)胞和IL-21共培養(yǎng)，加入 TGF-β 藥物抑制劑，Th17 細(xì)胞無法形成［28］。此外，研究表明，IL-6和IL-23通過介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)IL-23R mRNA 表達(dá)和Th17 細(xì)胞分化，而抗TGF-β 幾乎完全抑制 IL-23R mRNA 上調(diào)及 IL-6 和IL-23誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化［29］。

1.3 Treg/Th17 分化平衡 Th17 細(xì)胞和 pTreg 均在TGF-β 信號(hào)作用下由初始CD4+T 細(xì)胞分化而來。Th17 細(xì)胞分泌促炎因子引發(fā)自身免疫和炎癥反應(yīng)，Treg 可抑制這種情況，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)［30］。Treg/Th17 平衡與自身免疫性肝炎、腫瘤、膿毒癥等發(fā)生發(fā)展相關(guān)［31-33］。TGF-β在T細(xì)胞分化和發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫耐受中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［34］。TGF-β 既可調(diào)控Foxp3表達(dá)，也可影響RORγt表達(dá)。Foxp3是初始 T 細(xì)胞分化為 Treg 的重要調(diào)節(jié)因子，RORγt 對(duì)Th17 細(xì)胞分化起關(guān)鍵作用。Th17 細(xì)胞可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并在功能上對(duì)抗Treg。Th17細(xì)胞和iTreg從初始T 細(xì)胞分化取決于TGF-β 表達(dá)水平。低水平TGF-β、IL23 或 IL-6 誘導(dǎo)幼稚 T 細(xì)胞發(fā)育為 Th17 細(xì)胞［35］。組織微環(huán)境中高水平 TGF-β 可能導(dǎo)致 iTreg產(chǎn)生［36］。介導(dǎo) IL-6 的 STAT3 可誘導(dǎo) RORγt 表達(dá)，并在Th17 細(xì)胞分化中起作用；而介導(dǎo)IL-2 和IL-5 的STAT5 可直接結(jié)合 Foxp3 基因，誘導(dǎo) Treg 發(fā)育和功能［37］。因此，初始 CD4+T 細(xì)胞在微環(huán)境中 TGF-β 和IL-6 同時(shí)存在時(shí)，可上調(diào) RORγt 表達(dá)，向 Th17 細(xì)胞分化，在缺乏促炎因子如 IL-6 時(shí)，TGF-β 促進(jìn) CD4+T細(xì)胞分化為 Treg［31］。IL-2 和 IL-15 通過 STAT5 通路上調(diào)Foxp3 基因表達(dá)，誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Treg分化［38］。低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）通過下調(diào)Foxp3 基因，一方面可抑制初始CD4+T 細(xì)胞向Treg 分化，另一方面通過STAT3 通路正向調(diào)控，使初始CD4+T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞方向分化。代謝性產(chǎn)物如維A 酸在TGF-β 作用下，上調(diào)Foxp3 表達(dá)，抑制 IL-6 表達(dá)，促進(jìn)初始 CD4+T 細(xì)胞向Treg分化（圖1）。

圖1 Treg和Th17細(xì)胞分化與平衡Fig.1 Differentiation and balance of Treg and Th17 cell

1.4 Treg/Th17 相關(guān)通路 雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，感受氨基酸、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等改變，調(diào)節(jié)各種基本細(xì)胞過程，包括蛋白合成、生長(zhǎng)、代謝、衰老、再生、自噬等［39］。研究表明，敲除 Raptor 可導(dǎo)致 mTOR 通路功能受損小鼠發(fā)生炎癥相關(guān)性疾病，被輸入的正常小鼠Treg 效果減輕或逆轉(zhuǎn)，而輸入Raptor 敲除小鼠Treg 則無效［40］。因此，mTOR 依賴于 Treg 的免疫抑制功能。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinas，AMPK）是細(xì)胞能量傳感器，是調(diào)節(jié)機(jī)體能量的關(guān)鍵分子，可通過促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化和抑制乙酰輔酶A 羧化酶活性快速提供能量［41-42］。研究表明，肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）可通過AMPK調(diào)節(jié)Treg代謝和能量穩(wěn)態(tài)，LKB1缺陷小鼠導(dǎo)致Treg數(shù)減少和功能喪失，導(dǎo)致自身免疫性疾?。?3］。部分小分子蛋白也可調(diào)節(jié)Treg/Th17 平衡，如雌激素受體α（ERRα）可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，敲除小鼠ERRα后，小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞表達(dá)受抑制［44］。低膽固醇飲食可通過激活肝X 受體（liver X receptors，LXRs）調(diào)節(jié)膽固醇代謝改善 Th17/Treg 平衡［45］。LXRs 激動(dòng)劑T0901317 可抑制 IL-17 有效轉(zhuǎn)錄，抑制 Th17 細(xì)胞增殖［46］。

2 Treg/Th17與膿毒血癥

2.1 膿毒血癥與Treg/Th17 失衡 膿毒癥是一種對(duì)宿主感染引起的免疫反應(yīng)失調(diào)進(jìn)而威脅生命的MODS［47］。膿毒癥的特點(diǎn)是早期出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），后期出現(xiàn)免疫抑制、消炎或以代償性抗炎反應(yīng)綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS）［48-49］。膿毒癥發(fā)生發(fā)展可能與免疫功能紊亂密切相關(guān)。膿毒癥早期和晚期，T 細(xì)胞在免疫功能抑制或免疫過激方面均發(fā)揮重要作用［50］。膿毒癥患者Th17/Treg 失衡與MODS 進(jìn)展關(guān)系密切。Th17 細(xì)胞分泌IL-17，IL-17 可能通過阻止IL-10過度產(chǎn)生減少繼發(fā)性抗炎反應(yīng)，從而改善嚴(yán)重膿毒癥。膿毒癥早期患者中，缺乏IL-17 可能加重膿毒血癥晚期階段免疫失衡［51］。嚴(yán)重膿毒癥患者中，激活的Foxp3+Treg 最初被炎癥刺激所淹沒，但疾病后期，Treg 具有顯著保護(hù)作用。Treg 缺失使晚期生存率惡化，由此可知，F(xiàn)oxp3+Treg 在嚴(yán)重膿毒癥后期發(fā)揮有益作用。表明，Treg 抑制能力不足以控制嚴(yán)重炎癥和早期死亡率，但卻是嚴(yán)重膿毒癥恢復(fù)的先決條件［52］。

2.2 中藥調(diào)控Treg/Th17 平衡 Th17 細(xì)胞主要通過分泌IL-17 和IL-6 引起炎癥反應(yīng)，而Treg 則通過分泌TGF-β 和IL-10 發(fā)揮抗炎作用。研究表明，Th17/Treg 失衡與膿毒癥和各種炎癥性疾病有關(guān)［51，53-54］。因此，調(diào)節(jié) Th17/Treg 平衡可能是治療膿毒癥的有效措施［33］。HOU 等［55］通過盲腸結(jié)扎穿刺法建立小鼠膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)小劑量和中劑量（100 mg/kg 和200 mg/kg）黃芪多糖處理可減少膿毒癥小鼠Th 細(xì)胞數(shù)，抑制Th2 細(xì)胞和Treg 極化，減輕膿毒癥小鼠腎損傷，而大劑量（400 mg/kg）黃芪多糖可過度逆轉(zhuǎn)Th/Treg 反應(yīng)失調(diào)損傷器官。CHEN等［56］采用體外T 細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，觀察血必凈注射液對(duì)膿毒癥小鼠Treg和Th17細(xì)胞分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地塞米松對(duì)照組膿毒癥小鼠存活率無顯著提高，而血必凈注射液可通過直接和間接增強(qiáng)Treg 功能，拮抗 TNF-α 和 IL-6，抑制 Th17 細(xì)胞分化和增殖，在促炎階段抑制炎癥進(jìn)展，提高膿毒癥小鼠感染性休克存活率。LIU 等［57］實(shí)驗(yàn)表明，膿毒癥小鼠外周血、脾臟和胰腺組織Th1、Th17 細(xì)胞明顯增多，Treg減少；而黃芩苷可能作用于RORγt受體，通過RhoAROCK途徑抑制Th1和Th17反應(yīng)，促進(jìn)Treg增殖，減少IFN-γ 和IL-17 炎癥因子釋放，減輕膿毒癥小鼠胰腺損傷。CHEN 等［58］發(fā)現(xiàn)，姜黃素可提高血漿IL-10水平，抑制膿毒癥小鼠血漿TNF-α和IL-6分泌，顯著減輕膿毒癥小鼠肺部和腎臟炎癥性損傷，可將膿毒癥小鼠存活率顯著提高至60%（對(duì)照組為20%），進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡述姜黃素可能通過NF-κB 信號(hào)通路增強(qiáng) Treg 功能，減少 TNF-α 和 IL-6 炎癥因子釋放，從而提高膿毒癥小鼠存活率。GAO 等［59］發(fā)現(xiàn)膿毒癥組小鼠出現(xiàn)充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死和變性等改變，且脾臟CD3+CD4+T 細(xì)胞和CD3+CD8+T 細(xì)胞凋亡率提高，丹參酮Ⅱ-A 可作用于高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）受體，降低血清 HMGB1 水平，降低脾臟 CD4、CD8+T 細(xì)胞比例，增加脾臟中Treg 數(shù)，改善膿毒癥小鼠器官損傷和生存率。綜上，中藥在調(diào)控Treg/Th17 平衡治療膿毒癥方面療效顯著，但具體機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

Treg 與Th17 細(xì)胞分化需要多種調(diào)節(jié)因子參與，其中Foxp3 在Treg 分化中起關(guān)鍵作用，IL-6 和IL-21是誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子。Treg/Th17 平衡在自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥等疾病中發(fā)揮維持免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)作用。近年隨著人們對(duì)Treg/Th17 平衡與疾病關(guān)系的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其與膿毒癥關(guān)系密切。盡管護(hù)理和醫(yī)療水平有大幅提高，膿毒癥在ICU 死亡原因中依居高不下，迫切需要探索其發(fā)病機(jī)制，制定有效治療措施［60］。中藥在調(diào)節(jié)Treg/Th17 平衡方面發(fā)揮重要作用。如氧化苦參堿可抑制Th17 細(xì)胞分化，促進(jìn)Treg分化調(diào)節(jié) Treg/Th17 平衡［61］。探討 Treg/Th17 平衡與膿毒癥的關(guān)系，可以明確膿毒癥發(fā)病機(jī)制，為臨床靶向治療提供方向，為膿毒癥早期診斷與治療提供新思路。目前，雖然開展了多個(gè)中藥調(diào)節(jié)Treg/Th17 平衡治療膿毒癥的研究，但深度不夠，仍需加大中藥治療膿毒癥療效和機(jī)制研究。