基于虛擬仿真技術(shù)的醫(yī)學(xué)免疫學(xué)線上綜合性實驗教學(xué)研究——以免疫細胞治療細胞制品質(zhì)控實驗教學(xué)為例①

陳 瑾 許 健 胡正軍 周云凱 （浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，杭州310053）

推進課堂革命，開展形成性教學(xué)評價，提高教學(xué)質(zhì)量，是一項政府積極引導(dǎo)、高校致力實踐的重大戰(zhàn)略任務(wù)。在“互聯(lián)網(wǎng)+”背景下，現(xiàn)代信息技術(shù)與教學(xué)過程的深度融合被認為是實現(xiàn)課堂革命的主要手段［1］。新冠肺炎疫情的驟然降臨，迫使學(xué)生和任課教師全員“觸線”，據(jù)統(tǒng)計，約23 億人次投入到線上教學(xué)［2］，經(jīng)歷了一次真實徹底的“互聯(lián)網(wǎng)+教學(xué)”實戰(zhàn)。教育部發(fā)布了《在疫情防控期間做好普通高等學(xué)校在線教學(xué)組織與管理工作的指導(dǎo)意見》（教高廳［2020］2 號），要求各高校制定疫情防控期間在線教學(xué)實施方案。實驗教學(xué)注重操作，使得其開展線上教學(xué)尤為困難，而虛擬仿真技術(shù)為此提供了有效實現(xiàn)路徑，在實驗教學(xué)改革中發(fā)揮了重要作用。各高校充分利用國家虛擬仿真實驗教學(xué)項目共享平臺服務(wù)，依托虛擬仿真實驗課程資源提供在線實驗教學(xué)支撐和教學(xué)考核管理。

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是連接基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的重要橋梁課程，同時與細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)技術(shù)、預(yù)防醫(yī)學(xué)等多學(xué)科存在廣泛的交叉和滲透，是一門公認的既難教也難學(xué)的課程［3］。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗教學(xué)過程應(yīng)該注重實驗內(nèi)容符合臨床應(yīng)用，增強實用性和針對性，如近年的腫瘤免疫治療熱點問題和前沿研究被納入醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗教學(xué)體系［4］。腫瘤免疫療法是繼手術(shù)、化療、放療之后的第4種腫瘤治療模式，被譽為人類最有希望攻克癌癥的手段，其中研究最為深入的即嵌合抗原受體T 細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）［5］。CAR-T 療法包含 T 細胞分選、CAR 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入、T 細胞活化擴增、回輸觀察（圖1），其中T 細胞制品的質(zhì)量控制是回輸療效的關(guān)鍵，在《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》中要求對回輸細胞的活性、純度、功能性進行分析，目前臨床上多采用流式細胞儀進行回輸T細胞質(zhì)量監(jiān)測。流式細胞儀因其快速、準確、多參數(shù)的檢測特征，廣泛應(yīng)用于臨床血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和藥物學(xué)等多個學(xué)科，涵蓋了從基礎(chǔ)研究到臨床診斷等多個方面［6］，也是醫(yī)學(xué)免疫學(xué)關(guān)鍵技術(shù)，許多高校加強了對該技術(shù)的教學(xué)重視。

圖1 CAR-T治療原理及流程［5］Fig.1 Principle and procedure of CAR-T therapy［5］

但CAR-T 細胞質(zhì)控流式檢測在實際實驗教學(xué)中存在困難：①整個T細胞制品質(zhì)量檢測周期長，包括CAR-T 細胞體外培養(yǎng)和質(zhì)控檢測，整個周期在2 周左右，無法在單一、有限的教學(xué)時間和教學(xué)空間內(nèi)完成；②實驗無菌要求高，生物污染風(fēng)險大，細胞培養(yǎng)易受細菌、真菌、病毒等污染，需在無菌室內(nèi)進行，不適于對大批量學(xué)生進行公開教學(xué)；③流式細胞儀屬于高精密度、自動化復(fù)雜儀器，高校教學(xué)資源局限無法保障每位同學(xué)操作使用?；诖?，教研組以CAR-T 細胞制品質(zhì)控為主線，綜合流式細胞儀細胞活性、表面標記、細胞凋亡三大應(yīng)用技術(shù)，建立“免疫細胞治療中細胞制品質(zhì)量控制流式檢測的虛擬仿真實驗項目”，研究醫(yī)學(xué)免疫學(xué)線上綜合性實驗教學(xué)方法，借助虛擬仿真技術(shù)沉浸性、交互性和構(gòu)想性特征，設(shè)立虛擬情境實驗操作，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和自主性，培養(yǎng)探索精神。

1 教學(xué)目的

1.1 知識目標 鞏固腫瘤免疫和T 細胞免疫相關(guān)知識點，了解CAR-T 療法基本原理及實施過程中T細胞制品質(zhì)量控制的要素（包括細胞活性、CAR 陽性率表達和殺傷作用測定等），學(xué)會流式細胞儀調(diào)試、操作與維護，并對免疫細胞制品質(zhì)量進行檢測控制。

1.2 能力目標 通過視頻示教、任務(wù)發(fā)布、虛擬情境實操等教學(xué)實施，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣與探索精神，培養(yǎng)團隊協(xié)作意識，鍛煉檢驗實踐能力，增強醫(yī)學(xué)生臨床業(yè)務(wù)能力，提升教學(xué)效果。

1.3 素質(zhì)目標 “高校教育，以本為本”，要求提高人才培養(yǎng)的質(zhì)量，一方面讓學(xué)生了解和掌握免疫領(lǐng)域先進技術(shù)，拓寬學(xué)生視野，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維能力；另一方面形成質(zhì)控的管理思維，辯證思考問題，形成醫(yī)學(xué)嚴謹?shù)膽B(tài)度，樹立醫(yī)者的責(zé)任意識。

2 教學(xué)對象與方法

2.1 授課對象 選取醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)大三年級3 個班級的學(xué)生（共計100 人次）進行線上實驗教學(xué)探索。

2.2 教學(xué)方法 線上教學(xué)相較于傳統(tǒng)班級教學(xué)模式有其鮮明特征，從而改變教學(xué)方法趨向于“以學(xué)生為主體”的教學(xué)范式。線上教學(xué)是一種開放式課堂，打破原有教學(xué)時空觀，與傳統(tǒng)現(xiàn)場教學(xué)活動的一次性和即逝性相比，線上教學(xué)能夠反復(fù)進行，便于學(xué)生復(fù)習(xí)、理解和鞏固，較好地體現(xiàn)了個性化學(xué)習(xí)優(yōu)勢，因此抓好學(xué)生自律性是關(guān)鍵。同時線上教學(xué)可承載更多樣化的教學(xué)資源，書本是基礎(chǔ)資源，但已不再是唯一，針對本項目涉及的免疫療法，在線上教學(xué)中資源涵蓋從2018 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎關(guān)于PD-1 的新聞報道到頂級期刊上發(fā)表的腫瘤免疫治療研究進展，以及CAR-T 療法臨床應(yīng)用案例等，形成了在線教學(xué)資源的開放化、多樣化，引導(dǎo)學(xué)生在面對來自不同渠道的觀點和學(xué)說時，在其相互交鋒、互補之中加以理解、比較，從而拓寬視野，培養(yǎng)獨立思維能力和批判思考能力，實現(xiàn)主體介入學(xué)習(xí)，形成知識的建構(gòu)［1］。再者線上教學(xué)變革了從“面對面”傳授到“人對人”互動的教學(xué)觀，學(xué)生從僵化的班級集合體中解放出來，教師更關(guān)注在線的每一位學(xué)生個體的情況，學(xué)生亦可與老師一對一交流，突出了學(xué)生個性化需求，激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動性［7］。在線上教學(xué)特色基礎(chǔ)上，教師以虛擬仿真沉浸性、交互性實驗平臺為依托，在實驗導(dǎo)入及實驗實施過程中分別引入問題導(dǎo)向教學(xué)法和任務(wù)驅(qū)動式教學(xué)法，進一步增強學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和團隊溝通協(xié)作能力。

2.2.1 問題導(dǎo)向教學(xué)法 針對實驗教學(xué)目的，課前為學(xué)生設(shè)計了系列問題（表1），包括基本問題（學(xué)生通過理論學(xué)習(xí)給出答案）、重難點問題（需學(xué)生閱讀思考后回答）、實踐問題（應(yīng)用所學(xué)知識解決問題）及拓展問題（啟發(fā)性思考），促進同學(xué)深度參與，有效培養(yǎng)自主學(xué)習(xí)，啟迪智慧，學(xué)以致用。根據(jù)學(xué)生的回答及存在疑問，整合課本知識與課外拓展材料，制作了CAR-T 細胞免疫治療原理及流程演示視頻，引導(dǎo)學(xué)生主動學(xué)習(xí)掌握CAR-T 細胞制品質(zhì)量控制的要素，以及細胞制品質(zhì)量流式檢驗的方法及合格評價依據(jù)。

表1 問題導(dǎo)向教學(xué)Tab.1 Problem-based learning

2.2.2 任務(wù)驅(qū)動式教學(xué)法 任務(wù)驅(qū)動式教學(xué)為學(xué)生提供體驗實踐的情境和感悟問題的情境，在本實驗中，以臨床案例為背景，設(shè)定檢測實驗任務(wù)［8］：患者，60 歲女性，2014 年 9 月以“活動后乏力、皮膚紫癜”起病，2014 年11 月在醫(yī)院確診為急性B 淋巴細胞白血病，多次聯(lián)合化療未達完全緩解，骨髓原幼淋巴細胞在75%~88%。2015 年4 月2 日行外周血淋巴細胞單采，共采集淋巴細胞4.88×109個，淋巴細胞于體外分選、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，現(xiàn)需對細胞制品質(zhì)量評價，是否滿足輸注標準？

實驗前發(fā)布CAR-T 細胞制品合格率檢測任務(wù)，以小組為單位設(shè)置任務(wù)完成度考核。在小組任務(wù)分解過程中，使學(xué)生主動建構(gòu)探究、實踐、思考、運用，進行自主探索和互動協(xié)作的學(xué)習(xí)。最后對學(xué)習(xí)效果的評價主要包括兩部分內(nèi)容，一方面是對學(xué)生是否完成當(dāng)前問題的過程和結(jié)果評價，即所學(xué)知識的意義建構(gòu)評價；而更重要的一方面是對學(xué)生自主學(xué)習(xí)及協(xié)作學(xué)習(xí)能力的評價。在這個過程中，以任務(wù)為主線、教師為主導(dǎo)、學(xué)生為主體，學(xué)生會不斷獲得成就感，可以更大地激發(fā)其求知欲望，逐步形成一個感知心智活動的良性循環(huán)，從而培養(yǎng)出獨立探索、勇于開拓進取的自學(xué)能力。

3 教學(xué)過程

本虛擬仿真實驗涉及的內(nèi)容包括：CAR-T 細胞收集、染色、離心等前期處理，流式細胞儀調(diào)試與質(zhì)控檢測、CAR-T 細胞增殖實驗、細胞表面標記檢測、細胞凋亡檢測，具體流程如圖2，同時在整個實驗過程中貫穿生物安全小提示。

圖2 實驗流程Fig.2 Experimental procedure

3.1 自學(xué)檢查——問題式評估判斷 實驗導(dǎo)入中分析學(xué)生預(yù)習(xí)結(jié)果，對于T 細胞免疫和腫瘤免疫基礎(chǔ)問題，同學(xué)們通過課本查閱基本掌握，正確率在90%以上；而CAR-T 腫瘤治療原理和流式細胞術(shù)原理屬于實踐應(yīng)用范疇，學(xué)生涉獵有限，相對生疏，正確率約70%；對于免疫細胞治療療效的可能影響因素及腫瘤免疫治療前景的拓展性思考，同學(xué)們各抒己見，初見批判性思考成效。隨后針對本虛擬仿真實驗內(nèi)容，學(xué)生登錄系統(tǒng)后自動播放學(xué)習(xí)視頻（圖3），介紹免疫細胞治療研究進展，了解CAR-T 對腫瘤的特異性治療原理及治療流程，掌握流式細胞術(shù)在免疫細胞治療細胞制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

3.2 樣本制備——沉浸式場景體驗 制備CAR-T單細胞懸液，用 Fixable Viability Dye（FVD）死活細胞染色試劑盒鑒定轉(zhuǎn)染后T細胞活力與細胞增殖情況，判斷是否達到回輸量；隨后用CD19 蛋白抗體檢測CAR 轉(zhuǎn)染的陽性表達率，判斷特異性效果；最后將CAR-T 細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)，選用Annexin-V/PI 細胞凋亡試劑盒檢測腫瘤細胞凋亡，判斷CAR-T細胞殺傷作用。虛擬實驗中根據(jù)各試劑盒操作指南指導(dǎo)學(xué)生完成樣本制備過程（圖3），學(xué)生在虛擬生物安全柜中完成制樣步驟，直觀形象、立體生動地體驗、感知與領(lǐng)略，掌握樣本、試劑移液槍吸取、離心操作規(guī)范，學(xué)會合格樣本的判斷。

3.3 流式細胞儀檢測——交互式操作練習(xí) 樣本檢測前，模擬操作流式細胞儀開機質(zhì)控，掌握流式檢測技術(shù)的基本操作及儀器性能評價。質(zhì)控通過后方可開始檢測。進入虛擬仿真實驗練習(xí)環(huán)節(jié)，每一操作步驟均設(shè)置了說明，指導(dǎo)學(xué)生完成實驗方案的建立、上樣、數(shù)據(jù)采集（圖3），在關(guān)鍵步驟設(shè)置提問，如在流式細胞儀調(diào)試中，關(guān)鍵判讀質(zhì)控結(jié)果，包括變異系數(shù)（CV）和熒光強度均值（MFI）；CAR-T 陽性表達率和凋亡檢測模塊，涉及雙色熒光，注意熒光補償?shù)恼_調(diào)節(jié)，熒光溢漏會嚴重干擾陽性比例，從而幫助學(xué)生對假陽性、假陰性等異常結(jié)果的原因分析。系統(tǒng)實現(xiàn)實驗過程智能指導(dǎo)，學(xué)生與線上教師進行互動提問與答疑，教師掌握每位學(xué)生的線上學(xué)習(xí)狀態(tài)。系統(tǒng)具有錯誤提示和自動評價功能，學(xué)生通過人機交互的方式，實現(xiàn)邊練習(xí)、邊學(xué)習(xí)、邊調(diào)整，錯誤和不足之處及時得到改正和補充，增強體驗感和互動趣味性。

圖3 虛擬仿真實驗過程Fig.3 Process of virtual simulation experiment

3.4 CAR-T 細胞制品質(zhì)量評價——反思式思考評價 樣本檢測結(jié)束后，學(xué)生對實驗結(jié)果進行計算分析，F(xiàn)VD 染色陰性群占比判斷CAR-T 細胞量與細胞活力：CD19 和CD3 雙陽性細胞群比例指示anti-CD19 CAR-T 細胞轉(zhuǎn)染陽性表達率∶Annexin-V 陽性群比例說明CAR-T 細胞對腫瘤細胞殺傷作用。根據(jù)結(jié)果填寫實驗報告，學(xué)生可以反思自己的全部操作，并評價自己掌握的情況。學(xué)生根據(jù)評價結(jié)果，判斷是否可以進行回輸，從而提高學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)效果。

4 考核方法與教學(xué)成效

4.1 考核內(nèi)容

4.1.1 理論內(nèi)容 T 細胞免疫和腫瘤免疫相關(guān)知識點的考察；免疫細胞治療原理；流式細胞術(shù)檢測方法原理。

4.1.2 操作內(nèi)容 流式細胞儀調(diào)試及細胞活力、陽性表達率、凋亡的關(guān)鍵實驗操作及其注意事項、結(jié)果分析與判讀。

4.2 考核模式 包含實驗前測試、實驗過程提問解答、實驗報告和虛擬仿真實驗考核模塊4 個方面評價學(xué)生的學(xué)習(xí)效果（圖4）?？己四K通過人機對話模式參加考核，無步驟提示，同時根據(jù)關(guān)鍵性步驟評價實驗質(zhì)量，試劑量加入是否準確？流式質(zhì)控設(shè)定是否正確？數(shù)據(jù)分析是否合理？若操作不當(dāng)，上述關(guān)鍵結(jié)果將無法通過，則實驗失敗。系統(tǒng)將根據(jù)學(xué)生在考核中的表現(xiàn)給出系統(tǒng)評價和具體的數(shù)據(jù)分析，真正實現(xiàn)過程中全方位評價，并使考核、效果評估進一步規(guī)范化與標準化。

圖4 實驗考核內(nèi)容Fig.4 Content of experimental assessment

4.3 教學(xué)效果評價 本虛擬仿真實驗的教學(xué)研究注重學(xué)生自學(xué)能力和探索精神的培養(yǎng)，打破一張試卷定成績的慣例，構(gòu)建過程性考核評價體系。線上實驗教學(xué)的智能指導(dǎo)功能可實時統(tǒng)計學(xué)生學(xué)習(xí)情況，圖5 為2020 年3 月份學(xué)生線上學(xué)習(xí)情況及3 月13 日不同時段的學(xué)習(xí)次數(shù)，當(dāng)月累計在線學(xué)習(xí)1 975 次，日均 66 次，主要分布于 08：00~12：00 時間段，通過對學(xué)生學(xué)習(xí)規(guī)律的掌握，教師可針對性開展線上指導(dǎo)。實驗成績3 個班平均都在良好以上，同時對學(xué)生在學(xué)習(xí)興趣、合作能力、實踐能力和探索精神方面開展問卷調(diào)查，各項能力均有不同程度的提升，其中在學(xué)習(xí)興趣和實踐能力方面的提升度3 個班均高于50%，在探索精神方面提升度稍弱，低于30%（圖5），這可能是受以往重理論輕實踐思想影響，需在今后加強創(chuàng)新精神和科研思維的培養(yǎng)。

圖5 虛擬仿真實驗教學(xué)成效Fig.5 Teaching efficiency of virtual simulation experiment

5 討論

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是醫(yī)學(xué)類本科生教育的重點和難點，在此次新冠肺炎疫情防控大背景下，發(fā)展“互聯(lián)網(wǎng)+”線上實驗教學(xué)的重要性與必要性日漸突顯，已形成“多層次、多形式、多內(nèi)容”的立體化實驗教學(xué)體系。本實驗“免疫細胞治療細胞制品質(zhì)量控制虛擬仿真項目”創(chuàng)新了醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、臨床血液學(xué)、檢驗儀器學(xué)線上綜合實驗教學(xué)，打破時間、空間及課程界限；將啟發(fā)式教學(xué)和體驗式教學(xué)相結(jié)合，教師從“傳授者”轉(zhuǎn)變?yōu)椤耙龑?dǎo)者”，通過師生、生生間在線討論與答疑，幫助學(xué)生培養(yǎng)學(xué)習(xí)能動性，啟發(fā)自主學(xué)習(xí)和實踐。但線上教學(xué)以學(xué)生為主體，依賴學(xué)生學(xué)習(xí)的自律性，若學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力較弱，依賴他們自主學(xué)習(xí)、創(chuàng)新學(xué)習(xí)的教學(xué)改革倍感壓力。

此外針對實踐教學(xué)中周期長、風(fēng)險大、設(shè)備匱乏等局限，虛擬仿真技術(shù)以其沉浸性、交互性和構(gòu)想性特征，全數(shù)字建模仿真，虛擬空間情景漫游，體驗形象生動，解決了實驗教學(xué)困境，提升實踐技能；評價系統(tǒng)注重過程性評價，教學(xué)模式下每一個操作步驟均有標準提示，考核模式下有知識點測試分和操作步驟分，得分點、失分點一目了然，教學(xué)成效易評測、易統(tǒng)計、易分析。但虛擬仿真實驗程序無法完全預(yù)測學(xué)生在真實實驗過程中可能遇到的突發(fā)狀況，不利于學(xué)生應(yīng)變能力、分析問題和解決問題的能力培養(yǎng)［9］。

因此，有必要進一步研究現(xiàn)代信息技術(shù)教育教學(xué)規(guī)律，著力構(gòu)建線上線下聯(lián)動、課內(nèi)課外銜接、傳統(tǒng)創(chuàng)新融合的新型教學(xué)模式，促進教師“在線教學(xué)勝任力”到“雙線混融教學(xué)勝任力”的發(fā)展［10］。