甘露消渴膠囊通過JAK2/STAT3信號通路對糖尿病腎病大鼠的影響*

雷虹 ，張葉 ，肖偉利 ，蘇宏泉 ，楊宏昕

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)處，呼和浩特 010017；2.河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系，巴彥淖爾 015000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特 010017；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，呼和浩特 010017）

糖尿病腎病是糖尿病最重要的合并癥，目前已成為導(dǎo)致終末期腎臟病的重要因素[1]。血糖過高引起腎臟損害的機(jī)制主要是促進(jìn)腎小球基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，損害腎小球等微血管[2]，主要表現(xiàn)為尿量增多、蛋白尿等[3]。甘露消渴膠囊組方為熟地黃、生地黃、枸杞子、地骨皮、山茱萸、玄參、人參、黨參、黃芪、菟絲子、天花粉、當(dāng)歸、黃連、白術(shù)、桑螵蛸、天冬、麥冬、澤瀉、茯苓。功能滋陰補(bǔ)腎，健脾生津，臨床上主要用于治療非胰島素依賴型糖尿病[4]。本研究旨在觀察甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠的影響，以期為甘露消渴膠囊在臨床上用于治療糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2016-0001。大鼠飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價(jià)研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK（蒙）2014-0003，屏障系統(tǒng)內(nèi)溫度20～25℃，濕度40%～50%，每日光照12 h，光暗循環(huán)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食飲水。

1.2 受試藥物及試劑 甘露消渴膠囊購于吉林省正和藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：180412，規(guī)格：每丸質(zhì)量0.3 g，口服，每日3次，每次5粒。鹽酸二甲雙胍片，購于中美上海施貴寶制藥有限公司，口服，每日 2次，每次 1片，每片 0.5 g，批號：abh5048。纈沙坦膠囊：諾華制藥有限公司，口服，每日2次，每次1粒，每粒80 mg，批號：Z2702。TMS-P超敏試劑盒，批號：180625391h；DAB顯色試劑盒，批號：1807240031B，以上試劑購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶JAK2抗體（JAK2），批號：bs-0908R；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3單克隆抗體（STAT3），批號：bsm-33218M，以上抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。檸檬酸，批號：20180521；檸檬酸三鈉，批號：20180604；磷酸鹽緩沖溶液（PBS），批號：20180527；無水乙醇，批號：20180613；水合氯醛，批號：20171211；二甲苯（AR級），批號：20170801，以上試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。鏈脲佐菌素（STZ），批號：SLBB8126V，美國Sigma公司。尿蛋白定量測試盒，批號：180621；尿素氮 （BUN）測試盒，批號：180617；肌酐（Scr）測定試劑盒，批號：180315，以上試劑均購于南京建成生物工程研究所。膽固醇，批號：20180811；膽酸鈉，批號：20180107，以上試劑購于成都華夏化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模、給藥 70只雄性SPF級SD大鼠，隨機(jī)選取10只為空白對照組，其余大鼠用高脂高糖飼料（普通飼料66.5%，豬油10%，蔗糖15%，蛋黃7%，膽酸鈉0.5%，膽固醇1%。）喂養(yǎng)4周[5]。4周后大鼠禁食12 h，除空白對照組外其余大鼠腹腔注射經(jīng)0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.0）配置的STZ（11 mg/mL，5 mL/kg）[6]。繼續(xù)維持飼養(yǎng) 4 周后，連續(xù)3次隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L且24 h尿蛋白≥30 mg/L即為造模成功[7]。本研究中60只造模大鼠，有42只大鼠造模成功，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組10只、甘露消渴膠囊低劑量組（0.93 g/kg生藥）11只、甘露消渴膠囊高劑量組（1.86 g/kg生藥）11只、二甲雙胍合并纈沙坦組（180mg/kg，14.4mg/kg）10只。各給藥組灌胃體積為10 mL/kg，空白對照組及模型組灌胃等體積蒸餾水，治療給藥8周后測24 h尿蛋白，尾靜脈采血測隨機(jī)血糖，10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，檢測血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），最后取腎臟福爾馬林溶液固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化技術(shù)檢測JAK2及STAT3在腎組織的表達(dá)。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色方法 腎組織經(jīng)福爾馬林溶液固定24 h后從固定液中取出脫水，石蠟包埋，制作2 μm石蠟切片，進(jìn)行HE染色。觀察各組大鼠腎臟病理改變[8]。

1.3.3 免疫組化法測定腎臟JAK2及STAT3表達(dá) 取相同部位腎組織，石蠟包埋，制作5 μm石蠟切片，切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，10%山羊血清室溫封閉孵育 10 min，傾去血清，滴加一抗（JAK2 1∶200；STAT3 1∶250），4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育15 min，PBS沖洗，滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，于37℃孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色劑顯，5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。免疫組化圖片采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，根據(jù)灰度值計(jì)算光密度值（OD），OD=log[gv0/gv）][9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠隨機(jī)血糖的影響 與空白對照組比較模型組隨機(jī)血糖顯著升高（P<0.01），與模型組比較甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組、二甲雙胍合并纈沙坦組隨機(jī)血糖顯著降低（P<0.01）。見表1。

表1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠隨機(jī)血糖的影響（±s）Tab.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on random blood glucose of diabetic nephropathy rats（±s）

表1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠隨機(jī)血糖的影響（±s）Tab.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on random blood glucose of diabetic nephropathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 治療后隨機(jī)血糖（mmol/L）空白對照組 10 - 5.34±0.51模型組 10 - 21.34±1.43*甘露消渴膠囊低劑量組 11 0.93 g/kg生藥 17.98±1.80#甘露消渴膠囊高劑量組 11 1.86 g/kg生藥 16.43±1.22#二甲雙胍合并纈沙坦組 10 180 mg/kg，14.4 mg/kg 14.24±2.00#

2.2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠尿蛋白、血Scr及血BUN的影響 與空白對照組比較模型組尿蛋白、血Scr及血BUN含量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組和二甲雙胍合并纈沙坦組尿蛋白、Scr及BUN含量顯著降低（P<0.01）。見表2。

表2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠尿蛋白、Scr及BUN的影響（±s）Tab.2 Effects of Ganlu Xiaoke Capsule on urinary protein，Scr and BUN in diabetic nephropathy rats（±s）

表2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠尿蛋白、Scr及BUN的影響（±s）Tab.2 Effects of Ganlu Xiaoke Capsule on urinary protein，Scr and BUN in diabetic nephropathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)劑量尿蛋白（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）空白對照組 10 - 8.22±1.07 41.10±5.39 6.21±1.07模型組 10 - 49.82±3.01* 69.92±3.01* 12.49±0.82*甘露消渴膠囊低劑量組 11 0.93 g/kg生藥 38.76±3.79# 54.76±3.79# 8.17±0.68#甘露消渴膠囊高劑量組 11 1.86 g/kg生藥 32.51±2.57# 52.51±2.57# 8.40±0.78#二甲雙胍合并纈沙坦組 10 180 mg/kg，14.4 mg/kg 29.91±4.20# 49.91±4.20# 8.62±1.33#

2.3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理損傷的影響 腎臟HE染色結(jié)果顯示空白對照組大鼠腎小球大小正常，形態(tài)規(guī)整，腎間質(zhì)未見炎癥浸潤，系膜區(qū)無可見增生，腎小管結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；模型組大鼠腎臟的腎小球明顯增大，系膜細(xì)胞增殖，系膜基質(zhì)增加，腎小管上皮細(xì)胞存在空泡（圖中黑色尖頭所指處）；與模型組比，甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組及陽性藥物對照組大鼠腎小球形態(tài)趨于正常，基底膜輕微增生，腎小管排列趨于完整，較模型組病變程度明顯減輕，見圖1。

圖1 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟病理損傷的影響（×400）Fig.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on renal pathological damage in diabetic nephropathy rats(×400)

2.4 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2及STAT3表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組腎臟組織JAK2及STAT3表達(dá)顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，甘露消渴膠囊低劑量組、甘露消渴膠囊高劑量組和二甲雙胍合并纈沙坦組腎臟組織JAK2及STAT3表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見表 3、圖 2、圖 3。

圖2 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2表達(dá)的影響（×400）Fig.2 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on JAK2 expression in kidney tissue of diabetic nephropathy rats(×400)

圖3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織STAT3表達(dá)的影響（×400）Fig.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats(×400)

表3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2及STAT3表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of JAK2 and STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats（±s）

表3 甘露消渴膠囊對糖尿病腎病大鼠腎臟組織JAK2及STAT3表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of JAK2 and STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 JAK2 OD值 STAT3 OD值空白對照組 10 - 0.128±0.020 0.098±0.019模型組 10 - 0.329±0.017* 0.301±0.019*甘露消渴膠囊低劑量組 11 0.93 g/kg生藥 0.252±0.023# 0.222±0.032#甘露消渴膠囊高劑量組 11 1.86 g/kg生藥 0.230±0.023# 0.203±0.020#二甲雙胍合并纈沙坦組 10 180 mg/kg，14.4mg/kg 0.186±0.020# 0.179±0.035#

2.5 各組大鼠隨機(jī)血糖與尿蛋白、Scr、BUN、JAK2及STAT3表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示各組大鼠隨機(jī)血糖與24 h尿蛋白量、血BUN含量、血Scr含量、JAK2及STAT3在腎組織的表達(dá)之間具有相關(guān)性，呈正相關(guān)（P＜0.01）。見表4。

表4 各組組大鼠隨機(jī)血糖與尿蛋白、Scr、BUN、JAK2及STAT3表達(dá)相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of random blood glucose and urinary protein，Scr，BUN，JAK2 and STAT3 expression in each group

3 討論

糖尿病腎臟病變是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其主要病變?yōu)槟I小球硬化癥，糖尿病腎臟病是以血管損害為主的腎小球病變[10]。糖尿病的早期腎臟體積增大，腎小球呈高濾過狀態(tài)，腎小球組織蛋白的非酶糖化可改變腎小球基底膜和系膜區(qū)基質(zhì)蛋白的特性，使腎小球基底膜通透性增加、腎小球基底膜增厚[11]。逐漸出現(xiàn)微量白蛋白尿，隨著糖尿病病程的延長出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、腎小球?yàn)V過率降低等癥狀[12]?？刂蒲强筛纳飘惓５哪I血流動(dòng)力學(xué)，延緩微量蛋白尿的出現(xiàn)，使已有微量蛋白尿的患者轉(zhuǎn)為明顯臨床蛋白尿的情況明顯減少。高血壓是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可以改善腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)、減少尿蛋白排出，抑制系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，改善濾過膜通透性[13]。甘露消渴膠囊由熟地黃、生地黃、枸杞子、地骨皮、山茱萸、玄參、人參、黨參、黃芪、菟絲子、當(dāng)歸、黃連、天花粉、白術(shù)、桑螵蛸、天冬、麥冬、澤瀉、茯苓組成，有研究表明其中的天花粉、地骨皮、澤瀉、黃連具有明確的降血糖作用；地骨皮、山茱萸具有可靠地降血壓作用，人參、黨參、黃芪、當(dāng)歸具有顯著的預(yù)防血管損傷及改善微循環(huán)的作用，以上藥理作用均能有效延緩糖尿病腎臟病的發(fā)生、發(fā)展。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，近年來炎癥反應(yīng)在其發(fā)病機(jī)制中的作用受到重視，高血糖可使腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成多種細(xì)胞因子如結(jié)締組織生長因子、胰島素樣生長因子-1、腫瘤壞死因子、白介素-6（IL-6）等[14]，其中 IL-6 與細(xì)胞膜上 IL-6 受體結(jié)合后能誘導(dǎo)JAK2/STAT3信號通路的活化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，引起腎小球血管通透性增強(qiáng)，腎小球的濾過膜損傷。腎小球損傷后產(chǎn)生蛋白尿誘使腎小球增殖肥大的形成。本研究表明甘露消渴膠囊可顯著降低糖尿病腎病大鼠JAK2及STAT3在腎臟組織表達(dá)，減輕糖尿病引起的腎小球增大及基底膜增生，降低尿蛋白、Scr及BUN含量，且上述藥理作用均與甘露消渴膠囊降低血糖作用呈正相關(guān)。

綜上所述，甘露消渴膠囊可通過降低糖尿病大鼠隨機(jī)血糖以及調(diào)控JAK2、STAT3在腎臟組織的表達(dá)，減輕高血糖對腎組織的病理損傷，改善腎功能，起到對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用的作用。