參苓白術散通過TLR4/MyD88通路對Lewis肺癌小鼠腫瘤凋亡的干預作用*

張云亭，劉羽茜，蔣宗鎣，董 秀，張 林，王靖宇，王艷杰

（遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，遼寧 沈陽 110847）

肺癌是近年來患病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤之一，對人類生命威脅極大。有資料表明，肺癌與長期吸煙有關，另外空氣污染、職業(yè)暴露、遺傳等也是肺癌的致病因素[1]。目前常用的肺癌治療藥物為鉑類抗腫瘤藥物[2]，但極易產生耐藥性。單純的更換化療藥物不僅無法解決問題，還會增加患者的毒副作用等不良反應。中藥因為其多靶點效應及復方組成的多樣性，在臨床腫瘤治療上獲得了廣泛應用。中醫(yī)藥治療腫瘤、抗腫瘤耐藥、預防轉移復發(fā)等作為新的研究方向已成為近年新的研究熱點[3-4]。肺癌的臨床表現有咳嗽咳痰、咳血、胸痛等，并伴隨炎性發(fā)熱癥狀，炎癥反應能夠促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。參苓白術散是“培土生金”的經典方劑，有實驗表明參苓白術散對炎癥反應有一定作用[5]。本課題組前期研究表明參苓白術散在細胞水平能夠通過TLR4信號通路調控腫瘤炎癥微環(huán)境，抑制肺癌細胞的增殖，因此本實驗通過建立Lewis肺癌小鼠模型，進一步觀察參苓白術散在體內通過TLR4/MyD88通路對Lewis肺癌小鼠腫瘤凋亡的干預效果和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性C57小鼠40只，體質量18～22 g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2011-0003。于遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。實驗麻醉后處死小鼠。所有實驗動物研究方法均符合遼寧中醫(yī)藥大學倫理委員會有關的動物實驗研究指導原則，且獲得本院動物護理和使用委員會批準審核。

1.2 細胞株 小鼠Lewis肺癌細胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 藥物和試劑 參苓白術散（北京同仁堂有限公司，批號：16101054）；順鉑（齊魯制藥有限公司，批號：1W2A1301004B）；TLR4抗體（批號：YT0744）、MyD88（批號：YT2928）、Cleavedcaspase 3（批號：9664T）和二抗（批號：A23920）均購自美國CST公司；SABC試劑盒（批號：SA1050）、DAB顯色試劑盒（批號：AR1021）均購自武漢博士德生物工程有限公司；TUNEL原位凋亡檢測試劑盒（批號：KGA702）、全蛋白抽提試劑盒（批號：KGP150）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（批號：KGPBCA）、預染蛋白分子量Maker（批號：KGM441）、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（批號：KGP113）、ECL檢測試劑盒（批號：KGP1121）均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.4 主要儀器 YrdimesSW07D0567蛋白印跡儀（威泰克有限公司）；EG1150C型包埋機、LKB-1超薄切片機、HI1220型烘片機（德國LEICA）；JEM-1011BX51型OLYMPUS顯微鏡（日本OLYMPUS）；ELITE300PLUS E5W0541基礎電泳儀電源（威泰克有限公司）；5415C高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；RM2235型手動石蠟切片機、UV-2540分光光度計（日本SHIMAZDU）；THZ-312臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司）；BL310/BL21S分析天平（德國Sartorius）；DolphinChemi－PlusIDPK1012012凝膠成像分析系統(tǒng)（威泰克有限公司）。

1.5 造模與分組 常規(guī)培養(yǎng)小鼠肺癌Lewis細胞，達到一定數量后收集細胞并計數，制作細胞懸液。雄性C57小鼠40只，采用腋窩皮下接種肺癌Lewis細胞懸液法建立Lewis肺癌小鼠模型。每只小鼠右側腋窩皮下接種濃度為1×107個/mL的細胞懸液0.1 mL；待形成腫瘤組織后每日用游標卡尺觀察測定腫瘤直徑，待其直徑達到50 mm3視為Lewis肺癌小鼠模型成功建立。將造模成功小鼠隨機分Lewis肺癌組、順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組，每組10只。

1.6 實驗給藥 按實驗方法[6]分別對4組進行周期為14 d的灌胃或腹腔注射給藥。順鉑組小鼠給予腹腔注射順鉑（5 mg/kg），1次/周，共2次。中藥組根據人的使用劑量（18 g/70 kg），按照體表面積折算法進行人和小鼠等效劑量換算給予參苓白術散（9.36 g/kg），1次/d，連續(xù)灌胃14 d；Lewis肺癌組小鼠灌胃給予等量生理鹽水；中藥+順鉑組小鼠給予參苓白術散（9.36 g/kg）連續(xù)灌胃14 d，1次/d，同時腹腔注射順鉑（5 mg/kg），1次/周，共2次。

1.7 觀察指標

1.7.1 小鼠體質量、腫瘤質量和腫瘤增長抑制率 實驗前、造模成功、治療第5天、治療第10天和治療第14天分別測定小鼠體質量；治療14 d后麻醉處死小鼠，手術剝取腫瘤組織進行質量稱量，計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率（%）=（模型組平均腫瘤質量-給藥組平均腫瘤質量）/模型組平均腫瘤質量×100%。

1.7.2 TUNEL染色法測定小鼠肺癌腫瘤組織凋亡的情況切片常規(guī)脫蠟，水合，二甲苯浸泡，再分別浸泡于無水乙醇中5 min；90%乙醇中2 min；80%乙醇中2 min；70%乙醇中2 min；蒸餾水中2 min。加20 μg/mL不含DNase的proteinase K，37 ℃反應20 min。PBS浸洗，3%的H2O2-甲醇溶液處理阻斷內源性過氧化物酶。PBS浸洗，滴加生物素標記液50 μL，37 ℃孵育1 h。PBS浸洗，滴加0.1 mL標記反應終止液，室溫孵育，PBS浸洗。加Streptavidin-HRP工作液50 μL，室溫孵育，PBS浸洗。DAB顯色。光學顯微鏡下觀察拍照，進行結果分析。藍色為正常細胞，棕黃色為凋亡細胞。計算細胞凋亡指數（AI）。細胞凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.7.3 免疫組化法測定腫瘤組織TLR4、MyD88和Caspase-3蛋白表達水平 切片消除內源性過氧化物酶，室溫封閉10 min，PBS浸洗，封閉，室溫孵育20 min。加一抗50～100 μL，37 ℃的濕盒中孵育2 h后，PBS浸洗。滴加增強劑50 μL，37 ℃孵育30 min后，PBS浸洗。加二抗，37 ℃孵育，PBS浸洗。DAB溶液顯色，鏡下觀察染色深淺，染好后用自來水輕柔沖洗，復染，蒸餾水沖洗，自來水返藍，梯度脫水封片。光學顯微鏡下觀察蛋白的表達情況，取3個高表達區(qū)域拍照保存并采用Image J軟件測定光密度值，進行統(tǒng)計分析。

1.7.4 Western blotting法測定組腫瘤組織TLR4、MyD88和cleaved-Caspase-3蛋白表達水平 腫瘤組織加入預冷Lysis Buffer裂解液，充分研磨，離心分離上清，獲得全蛋白提取物，采用BCA法進行總蛋白定量。選擇合適濃度的凝膠，配制SDS-PAGE的分離膠和濃縮膠，上樣進行電泳分離、轉膜，將蛋白轉移到PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉，搖床振蕩1～2 h進行封閉。加一抗（1∶1 000），4 ℃搖床振蕩孵育過夜。TBST洗滌，加二抗，室溫搖床振蕩反應1～2 h，TBST洗膜3次。ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像儀成像拍照，Gel-ProAnalyzer4 軟件進行數據分析，計算目的蛋白和內參的灰度，進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（）表示，符合正態(tài)分布和滿足方差齊性，采用單因素方差分析；組間比較采用LSD法分析，重復測量數據比較采用重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計圖采用GraphPad Prism7.0軟件進行繪制。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量、腫瘤質量及腫瘤生長抑制率比較 造模前和造模成功后各組小鼠體質量無明顯差異（P＞0.05）。治療第5天、第10天和第14天時，Lewis肺癌組和中藥組小鼠體質量升高，順鉑組和中藥+順鉑組小鼠體質量降低。與Lewis肺癌組比較，順鉑組小鼠體質量明顯降低（P＜0.01），中藥組小鼠體質量無明顯差異，中藥+順鉑組小鼠體質量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖1）

圖1 各組小鼠體質量比較（，n=10）

與Lewis肺癌組比較，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組小鼠腫瘤質量明顯降低（P＜0.01）；且中藥+順鉑組小鼠腫瘤質量明顯低于順鉑組、中藥組（P＜0.01）；順鉑組小鼠腫瘤生長抑制率為38.59%，中藥組小鼠腫瘤生長抑制率為30.14%，中藥+順鉑組小鼠腫瘤生長抑制率為44.51%。（見圖2）

圖2 各組小鼠腫瘤質量比較（，n=10）

2.2 各組小鼠腫瘤組織細胞凋亡結果比較 TUNEL染色腫瘤組織，棕色為凋亡細胞。Lewis肺癌組小鼠腫瘤組織中僅有少量凋亡細胞，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組小鼠腫瘤組織凋亡細胞數量則明顯增多。（見圖3）

圖3 各組小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況（TUNEL染色，標尺=20 μm）

順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組小鼠腫瘤細胞凋亡指數明顯高于Lewis肺癌組（P＜0.01），且中藥+順鉑組小鼠腫瘤細胞凋亡指數明顯高于順鉑組、中藥組（P＜0.01）。（見表1）

表1 各組小鼠腫瘤細胞凋亡指數比較（）

表1 各組小鼠腫瘤細胞凋亡指數比較（）

注：與Lewis肺癌組比較，aP＜0.01；與順鉑組比較，bP＜0.01；與中藥組比較，cP＜0.01

2.3 各組小鼠腫瘤組織細胞中TLR4、MyD88和Caspase-3蛋白表達水平比較 TLR4、MyD88和Caspase-3陽性細胞顯示為棕色。免疫組化結果顯示：與Lewis肺癌組比較，中藥組、順鉑組和中藥+順鉑組小鼠腫瘤組織中TLR4和MyD88陽性細胞數量明顯減少，平均光密度值明顯降低（P＜0.01），Caspase-3陽性細胞數量明顯增加，平均光密度值明顯升高（P＜0.01）。與順鉑組、中藥組比較，中藥+順鉑組中TLR4、MyD88和Caspase-3蛋白表達水平的變化更明顯（P＜0.01）。（見圖4～5）

圖4 各組小鼠腫瘤組織細胞中TLR4、MyD88 和Caspase-3 蛋白表達免疫組化圖（標尺=200 μm）

圖5 各組小鼠腫瘤細胞TLR4、MyD88 和Caspase-3 蛋白平均光密度值比較（，n=10）

2.4 各組小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88、cleaved-Caspase-3蛋白表達比較 Western blotting結果顯示：與Lewis肺癌組比較，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組小鼠腫瘤組織中TLR4和MyD88蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），cleaved-Caspase-3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。中藥+順鉑組小鼠腫瘤組織中TLR4、MyD88蛋白表達水平低于順鉑組、中藥組，Caspase-3蛋白表達水平高于順鉑組、中藥組（P＜0.01）。（見圖6～7）

圖6 各組小鼠腫瘤組織細胞中TLR4、MyD88和cleaved-Caspase-3 蛋白表達Western blotting 圖

圖7 各組小鼠TLR4、MyD88 和cleaved-Caspase-3 蛋白相對表達量比較（，n=10）

3 討 論

肺癌早期癥狀不明顯，大部分患者被確診時已是晚期。從中醫(yī)學角度分析，肺癌主要發(fā)病部位在肺，可分型為氣陰兩虛、肺脾氣虛、陰虛毒熱和氣滯血瘀四種[7]。脾屬土，肺屬金，脾肺兩臟關系密切，培土生金法能夠治療肺系疾病。參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)經典培土生金方，由人參、茯苓、白術、白扁豆、山藥、砂仁、陳皮、蓮子、薏苡仁、桔梗、炙甘草等藥物組成，具有益氣健脾、化濕止瀉的作用[8]。方中人參大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津養(yǎng)血。山藥補脾養(yǎng)胃，生津益肺，益氣養(yǎng)陰。桔梗宣肺祛痰、利咽排膿，在方中載藥上行，兼保肺氣。臨床上參苓白術散常用于治療肺脾氣虛、虛勞肺損引起的多種肺系疾病[9]。近年來參苓白術散又逐漸應用于腫瘤放化療后，減輕胃腸道反應癥狀，提高患者生活質量[10-11]。因此進一步研究參苓白術散對肺癌的干預效果和機制具有重要臨床意義。

現代醫(yī)學認為炎癥在肺癌的各個階段均有體現，持續(xù)的炎癥可以促使炎癥血管的生成從而形成炎癥微環(huán)境，在這種微環(huán)境中肺癌細胞更容易增殖和擴散，明顯增加了肺癌的轉移率。目前已有研究表明可以通過抑制炎癥微環(huán)境來抑制肺癌腫瘤細胞的增殖[12]。TLR4/MYD88通路是典型的炎癥通路之一。TLR4分布在細胞膜上，是一類參與非特異性免疫的重要蛋白分子。MyD88作為重要的轉導蛋白，可以被TLR4募集，在依賴的信號通路中有著關鍵作用[13]。TLR4信號通路激活，能夠通過TLR結構域傳遞給其依賴的MyD88，促進IRAK4和IRAK1磷酸化，最終激活IκB激酶和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促使IL-1、IL-6、IL-8等分泌增加，引起炎癥反應[14]。本課題組的前期研究結果表明，在體外實驗中參苓白術散含藥血清能夠下調TLR4的表達，從而干預肺癌SPCA1細胞的增殖。

細胞凋亡是近年的研究熱點。常見的兩條凋亡途徑為死亡受體介導的外源凋亡通路途徑和線粒體介導的內源性凋亡通路途徑[15]。參與細胞凋亡途徑的主要蛋白有Caspase家族、銜接蛋白、IAPs家族和Bcl-2家族[16]。其中Caspase-3被激活后細胞凋亡不可避免，被認為是影響凋亡的關鍵蛋白酶[17]。Caspase-3作為多種凋亡途徑共同的下游效應部分，是細胞凋亡級聯反應的必經之路，在細胞凋亡中起重要調控作用，是評價腫瘤治療藥物效果的重要指標之一[18-19]。本課題組前期體外實驗表明培土生金法能夠通過調控人肺腺癌SPCA1細胞Caspase-3的表達從而促進腫瘤細胞的凋亡[20]，體內實驗表明培土生金法能夠調控Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Bax和Bcl-2表達，促進腫瘤組織凋亡[21]。因此，本實驗通過建立Lewis肺癌小鼠模型，通過體內實驗觀察腫瘤組織的凋亡情況和Caspase-3、TLR4、MyD88蛋白表達水平，進一步探索其在體內治療肺癌的信號轉導機制。

本實驗結果顯示：經培土生金法復方參苓白術散干預后，Lewis肺癌小鼠腫瘤質量降低，腫瘤抑制率達到30.14%，參苓白術散聯合順鉑干預腫瘤抑制率可以達到44.51%，和單獨使用順鉑和參苓白術散比較，能夠提高腫瘤抑制率。并且參苓白術散能促進Caspase-3的蛋白表達水平，促進腫瘤細胞的凋亡，這可能與下調炎癥相關因子TLR4和MyD88的蛋白表達水平有關。

綜上所述，參苓白術散能通過TLR4/MyD88信號通路影響Lewis腫瘤小鼠腫瘤生長的微環(huán)境，從而促進腫瘤細胞的凋亡，為臨床培土生金法聯合化療藥物治療肺癌提供了實驗依據。