基于生物信息學(xué)的銀屑病基因集富集及免疫細(xì)胞浸潤分析

周 揚(yáng)，韓 露，方如男，趙 艷，郭 楊，翟 燁，李 萍，李建紅

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；3.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

銀屑病（Psoriasis）是一種遺傳與環(huán)境共同作用的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚［1］。銀屑病易于復(fù)發(fā)、影響美觀、可伴發(fā)代謝綜合征等系統(tǒng)性疾病，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。對銀屑病有效治療靶點(diǎn)的探索一直是皮膚科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

近年來，生物信息學(xué)越來越多的應(yīng)用于包括銀屑病在內(nèi)的自身免疫相關(guān)的疾病的發(fā)病機(jī)制研究。有研究者對篩選出的銀屑病差異基因進(jìn)行了基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes，KEGG）富集研究，然而這種方法可能會遺漏某些差異不顯著但功能重要的基因［2］。目前對于免疫細(xì)胞的研究也局限于T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等幾個種類，尚需全面系統(tǒng)的揭示參與銀屑病發(fā)病的多種免疫細(xì)胞的浸潤和作用機(jī)制。

本研究應(yīng)用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）進(jìn)行全基因組表達(dá)分析，根據(jù)基因表達(dá)與類別之間的相關(guān)性對基因進(jìn)行排名，篩選出在銀屑病中上調(diào)的基因集和通路［3］。同時，利用CIBERSOFT 反卷積算法進(jìn)行22 種免疫細(xì)胞浸潤分析，分析銀屑病中各類免疫細(xì)胞之間的相互作用，以期更深入的研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載編號為GSE6710，平 臺 為GPL96［（HG-U133A）Affymetrix Human Genome U133A Array］的芯片數(shù)據(jù)集和注釋文件。該研究包含26 個樣品，來自于13 位尋常型銀屑病患者的皮損和非皮損活檢樣本。

1.2 GSEA 分析

從GSEA 官網(wǎng)（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下 載GSEA（GSEA_4.0.3）軟 件 及c5.all.v7.0.symbol.gmt 和c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 文件，使用GSEA 軟件對芯片數(shù)據(jù)矩陣分別進(jìn)行1 000 次模擬分析，獲取GO 和KEGG 富集分析結(jié)果。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤矩陣

對來自GEO 數(shù)據(jù)的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，使用R軟件“Bioconductor-limma”包進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正。從CIBERSOFT 官 網(wǎng)（https：//cibersort. stanford.edu/）下載22 種免疫細(xì)胞基因表達(dá)矩陣及R 包，使用R 軟 件（https：//www. r-project. org/ R_3.6.3）“e1071”包獲取免疫細(xì)胞浸潤矩陣。運(yùn)用Perl 腳本，篩選P＜0.05 的可信樣本，獲得新的過濾后的免疫細(xì)胞浸潤矩陣。

1.4 樣本聚類評價

使用R 軟件進(jìn)行主成分分析，對過濾后的免疫細(xì)胞浸潤矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，并通過R 軟件“ggplot2”包獲取主成分分析圖像。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤評估

使用R 軟件繪制柱狀圖、熱圖、共表達(dá)熱圖、小提琴圖、成對差異圖，用以分析免疫細(xì)胞浸潤分布差異及其相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 GSEA 分析

在GO 富集分析中，共2 616 個基因集在銀屑病皮損中上調(diào)，其中526 個基因集FDR＜25%，558 個基因集P值＜0.05，見圖1A。主要富集于核分裂的調(diào) 節(jié)（regulation of unclear division）、染 色 體 分 離（chromosome segregation）等細(xì)胞增殖相關(guān)過程和細(xì)胞質(zhì)模式識別受體信號通路（cytoplasmic pattern recognition receptor signaling pathway）、天然免疫反應(yīng)的激活（activation of innate immune response）等免疫相關(guān)過程。表1 展示了在銀屑病皮損中上調(diào)的歸一化富集分?jǐn)?shù)（Normalized Enrichment Score，NES）排名前20 的基因集。

表1 GO 富集分析NES 前20 的基因集Tab 1 GO enrichment analysis of the top 20 gene sets of NES

在KEGG 富集中，共95 條通路在銀屑病皮損中上調(diào)，其中20 條通路FDR＜25%，21 條通路P值＜0.05，見圖1B。主要富集于細(xì)胞周期（cell cycle）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、嘧啶代謝（Pyrimidine metabolism）等細(xì)胞增殖相關(guān)過程和Nod 樣受體信號通路（Nod like receptor signaling pathway）、RIG-Ⅰ樣受體信號通路（RIG-Ⅰlike receptor signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll like receptor signaling pathway）等免疫相關(guān)過程以及P53 信 號 通 路（P53 signaling pathway）、膀 胱 癌（Bladder cancer）等癌癥相關(guān)通路。表2 展示了在銀屑病皮損中上調(diào)的NES 排名前20 的通路。

表2 KEGG 富集分析NES 前20 的基因集Tab 2 KEGG enrichment analysis of the top 20 gene sets of NES

圖1 銀屑病基因表達(dá)矩陣的GSEAFig 1 GSEA of gene expression matrix of scurf disease

2.2 免疫細(xì)胞浸潤分析

經(jīng)Perl 腳本P＜0.05 的篩選后，獲得包含26 個可信樣本的免疫細(xì)胞浸潤矩陣。對22 種免疫細(xì)胞的浸潤矩陣的主成分分析顯示銀屑病皮損樣本和非皮損樣本組間差異明顯，樣本來源可靠，能夠區(qū)分銀屑病皮損組和非皮損組，見圖2。

圖2 二維PCA 聚類圖Fig 2 Two dimensional PCA clustering diagram

2.3 免疫細(xì)胞浸潤分布及組間差異分析

圖3A、B 的熱圖、柱狀圖顯示了22 種免疫細(xì)胞在不同樣本中浸潤分布差異，前13 組為銀屑病非皮損組樣本，后13 組為銀屑病皮損組樣本。圖3C 為22 種免疫細(xì)胞的組間浸潤差異小提琴圖，藍(lán)色為非皮損組，紅色為銀屑病皮損組。如圖3C 所示22 種免疫細(xì)胞中組間浸潤顯著（P＜0.05）的有5 種。其中活化的記憶T 細(xì)胞（T cells CD4 memory activated，TM）、濾泡輔助性T 細(xì)胞（T cells follicular helper，Tfh）、M0 巨噬細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞在銀屑病皮損組中上調(diào)，未活化的肥大細(xì)胞在銀屑病皮損組中下調(diào)。圖3D 為以上5 種組間浸潤差異顯著的免疫細(xì)胞在來源于同一個體的樣本中的成對差異分析圖。

圖3 銀屑病皮損組與非皮損組免疫細(xì)胞浸潤差異Fig 3 The difference of immune cell infiltration between lesional and non lesional psoriasis

2.4 免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

活化的樹突狀細(xì)胞與Tfh 呈正相關(guān)（r=0.59），活化的肥大細(xì)胞與M0 巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.67）。未活化的肥大細(xì)胞和活化的記憶T 細(xì)胞TM 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.64），M1 巨噬細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞（T cells regulatory，Treg）呈 負(fù) 相 關(guān)（r= -0.63），M0 巨噬細(xì)胞和未活化的肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r=-0.58）。見圖4。

圖4 免疫細(xì)胞相關(guān)性分析Fig 4 Correlation analysis of immune cells

3 討論

在GO 富集分析中，核分裂、染色體分離等與細(xì)胞有絲分裂功能相關(guān)的基因集在銀屑病皮損中顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖活躍。在KEGG 富集分析中，涉及DNA 復(fù)制、核苷酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂質(zhì)代謝的信號通路在銀屑病皮損中顯著上調(diào)，為細(xì)胞增殖提供了能量供應(yīng)和物質(zhì)儲備。角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖是銀屑病的基本病理特征之一。在現(xiàn)有的發(fā)病機(jī)制的模型中，角質(zhì)細(xì)胞在疾病觸發(fā)早期和疾病慢性期方面起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)皮膚環(huán)境改變時，受損的角質(zhì)細(xì)胞釋放的抗菌肽與自身遺傳物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而激活樹突狀細(xì)胞開啟適應(yīng)性免疫，放大了局部免疫反應(yīng)，在這種炎癥環(huán)境中，IL17、TNF-α、IFN-γ 等細(xì)胞因子又激活了角質(zhì)細(xì)胞的增殖［4］。角質(zhì)細(xì)胞的增殖在銀屑病中的意義并不僅限于此，有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病角質(zhì)細(xì)胞中47.3%的上調(diào)基因與細(xì)胞因子的誘導(dǎo)信號無重疊，這表明銀屑病表皮可能存在不依賴于炎性細(xì)胞因子環(huán)境的內(nèi)在變化［5］。因此，抑制角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，減少細(xì)胞增殖所必需的能量供應(yīng)和物質(zhì)儲備，或許可以成為銀屑病治療的一種新思路。Zhang 等［6］通過刪除小鼠模型中角質(zhì)細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，顯著抑制了小鼠模型的皮膚增厚和炎癥反應(yīng)。這種通過抑制細(xì)胞代謝從而抑制細(xì)胞增殖的方法在腫瘤的研究中應(yīng)用頗多，主要集中于PI3K-AKT 信號通路。銀屑病與腫瘤存在著細(xì)胞過度增殖的相似性，且抑制細(xì)胞的能量供應(yīng)亦能有效減輕銀屑病皮膚增殖和炎癥反應(yīng)，對于銀屑病角質(zhì)細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝的研究，應(yīng)該進(jìn)行更加深入的研究。

Nod 樣受體、RIG-Ⅰ樣受體、Toll 樣受體均為模式識別受體，在先天免疫中起著識別病原體和內(nèi)源性細(xì)胞應(yīng)激信號的作用，從而激活NF-κB、MAPK等信號通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而介導(dǎo)免疫反應(yīng)［7，8］。因此這些模式識別受體信號通路的的負(fù)調(diào)控對于銀屑病的治療具有重要意義。眾所周知，P53 是一種抑癌基因，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，本研究顯示，P53 在銀屑病皮損組上調(diào)，結(jié)果與大多數(shù)研究相一致［9-11］。P53 在銀屑病皮膚中的表達(dá)可能是角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖所誘導(dǎo)的野生型蛋白，是一種對抗過度增殖的保護(hù)機(jī)制，只不過這種保護(hù)機(jī)制可能不足以減弱過度增殖狀態(tài)［12］。除誘導(dǎo)凋亡外，P53 也具有抗凋亡的功能，P53 可以靶向促生存的Bcl-2基因的miR-34，因此P53 信號不應(yīng)被視為單純的誘導(dǎo)凋亡［13］。

本研究得到的Tfh、Th 和活化的樹突狀細(xì)胞在銀屑病皮損中上調(diào)，活化的樹突狀細(xì)胞與Th 呈正相關(guān)的結(jié)果與現(xiàn)有銀屑病發(fā)病模型基本符合，即抗原激活樹突狀細(xì)胞后，樹突狀細(xì)胞對其進(jìn)行處理提呈，激活Th，分泌炎性細(xì)胞因子維持炎癥環(huán)境，而這種炎癥環(huán)境又促進(jìn)了TM 的增殖［14，15］。然而關(guān)于巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞，仍需進(jìn)一步討論。在本研究中，M0 巨噬細(xì)胞在銀屑病皮損組上調(diào)，M1 巨噬細(xì)胞與Treg 呈負(fù)相關(guān)。巨噬細(xì)胞分為M0、M1、M2 三種表型，M0 巨噬細(xì)胞為未經(jīng)激活的幼稚的巨噬細(xì)胞，M0 巨噬細(xì)胞收到M1 或M2 特異性信號則會被激活為M1 巨噬細(xì)胞或M2 巨噬細(xì)胞［16］。一般來說，M1 巨噬細(xì)胞的作用是介導(dǎo)炎癥和細(xì)胞/組織損傷，M2 巨噬細(xì)胞則調(diào)節(jié)銀屑病的抗炎和修復(fù)［17］。

本研究結(jié)果顯示，未活化的肥大細(xì)胞在銀屑病皮損組下調(diào)，而活化的肥大細(xì)胞卻未在皮損組上調(diào)。肥大細(xì)胞在許多皮膚病中是瘙癢的介導(dǎo)物，有研究表明，P 物質(zhì)在銀屑病斑塊中表達(dá)增加，而P 物質(zhì)在精神緊張的情況下可以導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而出現(xiàn)瘙癢［18，19］。正常皮膚中不會出現(xiàn)皮膚瘙癢，因而肥大細(xì)胞的活化程度較低，而在銀屑病皮損中，有部分患者會出現(xiàn)皮膚瘙癢，但并不具有普遍性，這可能是未活化的肥大細(xì)胞在銀屑病皮損組下調(diào)，而活化的肥大細(xì)胞卻未在皮損組上調(diào)的原因。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對銀屑病的表達(dá)譜芯片進(jìn)行了GSEA 及免疫細(xì)胞浸潤分析，得到了細(xì)胞增殖、免疫及癌癥相關(guān)通路在銀屑病中起到重要作用；免疫細(xì)胞浸潤與目前銀屑病發(fā)病模型大體符合，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞在銀屑病中也起著一定程度的作用的結(jié)論。本研究進(jìn)一步揭示了細(xì)胞增殖與免疫細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的重要作用，為銀屑病的臨床治療及藥物研究提供新的思路。但本研究是根據(jù)GEO 數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行的預(yù)測，其中可能會有假陽性或假陰性結(jié)論，研究結(jié)果尚待進(jìn)一步實驗驗證。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李建紅：提供本文思路；李萍：提供本文指導(dǎo)；周揚(yáng)：撰寫論文；周揚(yáng)、韓露、方如男：共同完成論文相關(guān)數(shù)據(jù)資料的獲取和處理；趙艷、郭楊、翟燁：協(xié)助完成數(shù)據(jù)分析和討論。