電子鼻結(jié)合氣相-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)分析蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

孫達(dá)鋒，胡小松，張沙沙

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）屬牛肝菌科（Boletaceae），牛肝菌屬（Boletus）[1]，俗稱“紅蔥”，盛產(chǎn)于云南、貴州等地，深受當(dāng)?shù)厝讼矏?。蘭茂牛肝菌一直被誤認(rèn)為雙色牛肝菌（Boletus bicolorRaddi）[2]、華美牛肝菌（Boletus speciosus）[3]，直到2016 年Wu 等[1]結(jié)合現(xiàn)代分子手段，才將其定名為蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）。新鮮蘭茂牛肝菌口感爽脆，并伴有奇鮮，雖有微毒性，但經(jīng)適當(dāng)加工后口味奇特；蘭茂牛肝菌營養(yǎng)組成均衡，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多糖等多種功效成分[4]。

目前關(guān)于蘭茂牛肝菌的研究較少，蘇璐等[5]研究了蘭茂牛肝菌含藥血清對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用；楊利梅等[6]研究了食用外共生菌根真菌蘭茂牛肝菌純培養(yǎng)條件下不同發(fā)育時期的核相。蘭茂牛肝菌屬于呼吸躍變型，采收后仍然進(jìn)行新陳代謝活動，導(dǎo)致其失重、萎焉、風(fēng)味改變甚至腐爛變質(zhì)，降低了蘭茂牛肝菌的食用價值和商品價值。蘭茂牛肝菌常用的保鮮技術(shù)是冷藏保鮮、速凍保鮮、保鮮劑保鮮等，這些保鮮技術(shù)雖然在一定程度上延長了蘭茂牛肝菌的貯藏期，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對營養(yǎng)、健康、美味的要求。而氣調(diào)貯藏保鮮技術(shù)是一種物理保鮮技術(shù)，具有保鮮時間長、效果明顯、無任何污染等優(yōu)點(diǎn)，但鮮用于蘭茂牛肝菌的保鮮。目前，關(guān)于食用菌揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜嗅聞（GC-O）等，也有采用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）及電子鼻等[7?10]。電子鼻是仿生物嗅覺系統(tǒng)，快速、重復(fù)性好、可以做到無損檢測，近年來廣泛用于肉類、酒類、果蔬[11?14]等農(nóng)產(chǎn)品檢測。GC-IMS 技術(shù)樣品處理簡單，直接頂空進(jìn)樣，能夠最大程度保留樣品自身風(fēng)味，分辨率高、靈敏度高，結(jié)果以直觀可視化的指紋圖譜呈現(xiàn)不同樣品的風(fēng)味差異，目前已廣泛應(yīng)用于食品品質(zhì)控制、糧油貯藏、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域[15?20]。但有關(guān)蘭茂牛肝菌氣調(diào)保鮮及揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究，均未見報道。

本文以蘭茂牛肝菌鮮品為研究對象，采用電子鼻結(jié)合氣相-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)分析蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為快速判斷蘭茂牛肝菌新鮮度及其調(diào)味品的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的蘭茂牛肝菌 采集于云南省玉溪市哀牢山，采集后全程冷鏈運(yùn)回中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所保存，挑選大小一致、無機(jī)械損傷的子實體用于實驗。

PEN3 電子鼻 德國AIRSENSE 公司；Flavour Spec?風(fēng)味分析儀 德國G.A.S 公司；YGCA 氣調(diào)試驗箱 北京陽光億事達(dá)科技有限公司；BSC-250 恒溫恒濕箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠司；KMS-50 試驗定制型真空預(yù)冷機(jī) 東莞市科美斯制冷設(shè)備有限公司；HW-XS-I-5G 臭氧發(fā)生器 廣州市環(huán)偉環(huán)?？萍加邢薰?；MXT-5 色譜柱 美國RESTEK 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 參考張燕等[21]和薛偉等[22]處理方法，并修改，將9 kg 新鮮蘭茂牛肝菌，在真空預(yù)冷機(jī)中進(jìn)行預(yù)冷，溫度為3 ℃，時間為10 min，進(jìn)行臭氧殺菌處理10 min（臭氧濃度為200 μg/L），放入氣調(diào)試驗箱：氣體成分為O26%、CO210%，溫度為（5±0.5）℃，濕度為90%，每隔6 d 隨機(jī)取樣檢測。1 號、2 號、3 號、4 號和5 號樣品分別代表新鮮蘭茂牛肝菌貯藏第1、7、13、19 和25 d 的樣品。

1.2.2 電子鼻分析 樣品間隔時間為1 s，沖洗時間為60 s，調(diào)零時間為10 s，測定時間為100 s，載氣流速為400 mL/min，環(huán)境溫度為18～20 ℃[23]。本研究選取數(shù)據(jù)較平穩(wěn)的50～52 s 用于后續(xù)分析，每個處理重復(fù)測定3 次。PEN3 電子鼻由10 個不同傳感器陣列組成，各傳感器代表的物質(zhì)種類及性能描述見表1。

表1 傳感器代表的物質(zhì)種類及性能描述Table 1 Material type and performance description represented by sensor

1.2.3 GC-IMS 分析方法 參考謝建春[24]的方法，并略作修改。樣品處理：取3.0 g 樣品，置于20 mL頂空瓶中，40 ℃孵化15 min 后進(jìn)樣500 μL，進(jìn)樣方式是頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣針溫度為85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速為500 r/min。

色譜柱：MXT-5；石英毛細(xì)管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm），載氣/漂移氣為高純N2；載氣流速分析時間為20 min，柱溫為 60 ℃。載氣流量0～2 min 為2 mL/min，2～20 min 為2～150 mL/min。漂移氣流量為150 mL/min，IMS 探測器溫度為45 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

電子鼻數(shù)據(jù)分析：采用Winmuster 分析軟件對采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

GC-IMS 數(shù)據(jù)分析：利用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀配套的分析軟件（VOCal、Gallery Plot、Reporter、DynamicPCA 等）對圖譜進(jìn)行差異分析，并通過應(yīng)用軟件內(nèi)置的IMS 數(shù)據(jù)庫和NIST 數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

采用Excel 2007 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對蘭茂牛肝菌的揮發(fā)性風(fēng)味響應(yīng)

2.1.1 蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間風(fēng)味雷達(dá)指紋圖譜

采用電子鼻對蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間5 個樣品的香氣輪廓進(jìn)行分析。PEN3 電子鼻的10 個傳感器對氣體敏感度不一樣，當(dāng)傳感器與氣體接觸時，相對電導(dǎo)率的比值G/G0與氣體濃度呈正比，當(dāng)G/G0>1時，說明氣體濃度大；當(dāng)G/G0≤1 時，說明沒有響應(yīng)氣體或氣體濃度低于檢測限[23]。由圖1 可以看出，電子鼻的10 個傳感器對不同貯藏期蘭茂牛肝菌的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均有響應(yīng)，并且響應(yīng)強(qiáng)度各不相同，所以利用電子鼻判斷蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間新鮮度具有可行性。由圖1 可以看出，W5S（氮氧化合物敏感）、W6S（氫氣敏感）、W5C（烷烴芳香成分敏感）、W2S（醇類敏感）傳感器的G/G0高于其他6 個傳感器；不同貯藏時間的蘭茂牛肝菌對10 個傳感器的反應(yīng)信號強(qiáng)度不同，其中，氣調(diào)貯藏第1 d 和第13 d 的強(qiáng)度明顯高于其他貯藏天數(shù)，說明氣調(diào)貯藏第1 d 和第13 d 的蘭茂牛肝菌的揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類和含量較高。另外，其他貯藏時間的蘭茂牛肝菌區(qū)分不明顯，反應(yīng)信號強(qiáng)度差別較小，而構(gòu)建主成分分析圖可直觀區(qū)分。

圖1 蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間風(fēng)味雷達(dá)指紋圖譜Fig.1 Radar map of flavor components of L. asiatica during controlled atmosphere storage

2.1.2 基于電子鼻方法的主成分分析 主成分分析（PCA）將電子鼻傳感器提取的多個指標(biāo)的信息進(jìn)行數(shù)據(jù)降維處理，提取主要因子進(jìn)行線性分析，觀察比較蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間的PCA 值在空間的分布差異[25?26]。由圖2 對不同氣調(diào)貯藏時間的蘭茂牛肝菌進(jìn)行PCA 分析可以看出，第1 主成分、第2 主成分貢獻(xiàn)率分別為94.08%、5.50%，總貢獻(xiàn)率為99.58%，不同氣調(diào)貯藏時間的5 個樣品完全不重疊，說明蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間的氣味有區(qū)別，可以利用電子鼻來區(qū)分。貯藏第1 d 和第13 d 的蘭茂牛肝菌在第1 主成分方向比較接近，而貯藏第7、19、25 d的蘭茂牛肝菌在第1 主成分和第2 主成分方向都比較接近，這可能與蘭茂牛肝菌的后熟作用有關(guān)。

圖2 基于電子鼻不同氣調(diào)貯藏時間的蘭茂牛肝菌PCA 圖Fig.2 PCA of L. asiatica during controlled atmosphere storage using electronic nose

2.1.3 基于電子鼻方法的LDA 分析 LDA 是模式識別的經(jīng)典算法，本質(zhì)上是一種投影，是將一個高維的點(diǎn)投影到一條高維的直線上，投影過程中盡量使同類別的數(shù)據(jù)點(diǎn)緊湊，而不同類別之間數(shù)據(jù)點(diǎn)的距離更大。由圖3 對不同氣調(diào)貯藏時間的蘭茂牛肝菌進(jìn)行LDA 分析可以看出，第1 主成分、第2 主成分貢獻(xiàn)率分別為95.94%、3.32%，總貢獻(xiàn)率為99.26%，貯藏第19～25 d 的蘭茂牛肝菌與貯藏第1～13 d 的蘭茂牛肝菌距離比較遠(yuǎn)，說明氣調(diào)貯藏第13 d 左右是新鮮度變化的拐點(diǎn)。

圖3 基于電子鼻不同氣調(diào)貯藏時間的蘭茂牛肝菌LDA 圖Fig.3 LDA of L. asiatica during controlled atmosphere storage using electronic nose

2.2 GC-IMS 檢測結(jié)果分析

2.2.1 蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間GC-IMS 二維譜圖分析 圖4 為蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間1 號（貯藏第1 d）、2 號（貯藏第7 d）、3 號（貯藏第13 d）、4 號（貯藏第19 d）、5 號（貯藏第25 d）樣品的GC-IMS二維譜圖。其中，橫坐標(biāo)代表遷移時間（ms），1.0 處紅色垂直線為反應(yīng)離子峰，每個樣品的遷移時間約2.04 ms，峰右側(cè)的每個點(diǎn)代表一種揮發(fā)性物質(zhì)，點(diǎn)的面積及顏色代表該物質(zhì)含量的大小，顏色越深，代表揮發(fā)性物質(zhì)的含量越高，顏色越淺，則反之；縱坐標(biāo)代表保留時間（s）。由圖4 可以看出，1 號樣品和3 號樣品的紅色點(diǎn)和淺藍(lán)色點(diǎn)的數(shù)量和面積明顯高于2、4、5 號樣品，說明蘭茂牛肝菌貯藏第1 d 和第13 d的揮發(fā)性物質(zhì)明顯高于其它貯藏時間。

圖4 蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間的二維GC-IMS 譜圖（俯視圖）Fig.4 Two-dimensional GC-IMS spectra in L. asiatica during controlled atmosphere storage (top view)

2.2.2 蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)Gallery Plot 指紋譜圖 為進(jìn)一步對比蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的差異性，利用GC-IMS 對蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，采用Gallery Plot 插件繪制了1、2、3、4、5 號樣品的揮發(fā)性物質(zhì)的離子遷移指紋圖譜，每個樣品做三次平行，見圖5。并采用GC-IMS 應(yīng)用軟件內(nèi)置的IMS 數(shù)據(jù)庫和NIST 數(shù)據(jù)庫對蘭茂牛肝菌貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，如表2 所示。

由圖5 和表2 可以看出，GC-IMS 在蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間共檢出50 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括16 種醛類、10 種醇類、6 種酮類、1 種酸類、1 種酯類和16 種未能識別的化合物；貯藏第1 d 和第13 d時揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最多，含量最豐富。有研究表明，八碳揮發(fā)性物質(zhì)是構(gòu)成食用菌風(fēng)味的主要成分，它們主要由亞油酸經(jīng)脂肪氧化酶催化而來[27?28]。蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間有7 種八碳揮發(fā)性化合物，主要是1-辛烯-3-醇及其二聚體、3-辛酮及其二聚體、苯乙醛、（E）-2-辛烯醛及其二聚體，其中，1-辛烯-3-醇及其二聚體變化不明顯，3-辛酮二聚體、苯乙醛呈先降低后升高的趨勢，3-辛酮呈逐漸升高的趨勢，貯藏第13 d 稍有回落，（E）-2-辛烯醛及其二聚體呈先降低后升高再降低的趨勢。含硫化合物是影響食用菌整體風(fēng)味的另外一個重要組成成分，蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間有3 種含硫化合物，包含3-甲基硫丙醛單體、3-甲基硫丙醛二聚體和甲硫醇，前兩者呈先升高后降低的趨勢，后者呈先降低后升高的趨勢。

圖5 蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的Gallery Plot 指紋圖譜Fig.5 Gallery Plot of volatile compounds in L. asiatica during controlled atmosphere storage

表2 GC-IMS 測得的蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Volatile compounds of L. asiatica during controlled atmosphere storage

由圖5 可以看出，蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)1-辛烯-3-醇及其二聚體、異戊醇、異丙醇及其二聚體、2-甲基-1-丁醇變化趨勢不明顯，甲硫醇、2-甲基-1-戊醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、（E）-2-己烯-1-醇呈先降低后升高的趨勢；醛類物質(zhì)一般發(fā)生斯特勒克爾（Strecker）降解或脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，香味閾值一般較低[29?30]，由圖5 可以看出，醛類物質(zhì)在蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間含量變化較明顯，蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間（E）-2-辛烯醛及其二聚體、3-甲基硫丙醛及其二聚體呈較明顯的降低趨勢；庚醛、己醛及其二聚體、苯乙醛、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛，呈先降低后升高的趨勢；3-甲基丁醛及其二聚體、苯甲醛及其二聚體、（E）-2-庚烯醛及其二聚體呈先升高后降低的趨勢，貯藏第13 d 左右達(dá)到峰值；酮類物質(zhì)具有獨(dú)特的香味，香味閾值也較低[31?32]，蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間3-辛酮及其二聚體、2-庚酮及其二聚體、2,3-丁二酮、二氫-2（3h）-呋喃酮呈先降低后升高的趨勢；丙酸、甲酸乙酯呈逐漸降低的趨勢。蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間醛類的種類和含量明顯減少，酮類種類和含量在增加，苯乙醛和丙酸可作為蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間特征性揮發(fā)性物質(zhì)，苯乙醛呈甜香、濃郁的玫瑰花香，丙酸呈酸味果香[33?34]。

2.2.3 基于GC-IMS 的蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)PCA 分析 為更直觀分析蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，運(yùn)用PCA 插件程序?qū)?～5 號樣品作聚類分析，見圖6。

圖6 基于GC-IMS 的氣調(diào)貯藏期間蘭茂牛肝菌的PCA 分析Fig.6 PCA analysis of L. asiatica during controlled atmosphere storage based on GC-IMS

由圖6 可以看出，不同氣調(diào)貯藏期的蘭茂牛肝菌的揮發(fā)性物質(zhì)沒有明顯的重疊區(qū)域，說明采用GC-IMS 技術(shù)結(jié)合主成分分析，可以區(qū)分不同氣調(diào)貯藏期的蘭茂牛肝菌，也就是可以區(qū)分蘭茂牛肝菌的新鮮度。PC1 和PC2 的累計貢獻(xiàn)率達(dá)69%，氣調(diào)貯藏第1 d 和第13 d 的蘭茂牛肝菌在第1 主成分方向比較接近，樣品2 與樣品4 距離比較近，氣調(diào)貯藏13 d的樣品距離其它樣品較遠(yuǎn)，說明其揮發(fā)性物質(zhì)與其他樣品明顯不同，可能與蘭茂牛肝菌的后熟作用有關(guān)，這與電子鼻檢測結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

采用電子鼻和GC-IMS 技術(shù)從宏觀和微觀上對氣調(diào)貯藏期間的蘭茂牛肝菌的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。電子鼻可以有效區(qū)分不同氣調(diào)貯藏時間的蘭茂牛肝菌，氣調(diào)貯藏13 d 左右是蘭茂牛肝菌新鮮度變化的拐點(diǎn)，貯藏第13～25 d 蘭茂牛肝菌仍可食用，但風(fēng)味欠佳。GC-IMS 構(gòu)建的香氣輪廓共有50 種揮發(fā)性香氣成分被檢出，其中包括包含16 種醛類、10 種醇類、6 種酮類、1 種酸類、1 種酯類和16 種未被識別，貯藏第1 d 和13 d 時揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量最高。蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量（主要為醛酮類物質(zhì)）隨著貯藏時間的延長而改變，醛類化合物的種類和含量明顯減少，酮類化合物種類和含量增加，以醛類和醇類為主的八碳化合物揮發(fā)性香氣成分對蘭茂牛肝菌的香氣貢獻(xiàn)最大，苯乙醛和丙酸可作為蘭茂牛肝菌氣調(diào)貯藏期間特征性揮發(fā)性物質(zhì)。

電子鼻和GC-IMS 聯(lián)用可快速直觀地對不同氣調(diào)貯藏時間的蘭茂牛肝菌進(jìn)行差異分析，并可快速判斷蘭茂牛肝菌的新鮮度。本研究建立了蘭茂牛肝菌不同貯藏期（新鮮度）揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜，可為判斷蘭茂牛肝菌新鮮度提供一定的理論依據(jù)。