黃柏堿對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化的抑制作用及其機制研究*

許孟秋，陸韻薇，易慧敏，于顧然

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

神經(jīng)退行性疾?。╪eurodegenerative disease，ND）[1]是由于老年后中樞神經(jīng)慢性進行性變性而產(chǎn)生的疾病，包括多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等。目前ND已成為威脅人類健康的第三位疾病，僅次于心血管疾病、癌癥。研究[2-5]表明小膠質(zhì)細胞的活化在上述疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。

黃柏味苦性寒，能清熱燥濕，瀉火解毒，臨床上用于治療瀉痢、黃疸、帶下、淋證、骨蒸勞熱等?，F(xiàn)代研究[6-8]顯示，黃柏有多途徑抗炎作用。黃柏堿是《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的黃柏的活性成分、質(zhì)檢成分之一[9]。藥物代謝動力學(xué)表明大鼠注射黃柏堿（2 mg/kg）后，在腎臟中濃度最高，并可穿過血腦屏障[10]。研究表明，黃柏堿能通過抑制腎小球中巨噬細胞和細胞毒性T淋巴細胞的增殖或遷移的能力來發(fā)揮抗腎炎的作用[8]，還能通過阻滯自主神經(jīng)節(jié)發(fā)揮降壓作用[11]。黃柏堿具有抑制細胞免疫[12-13]、抗氧化[14-15]、神經(jīng)保護等作用[14]。黃柏有效成分之一小檗堿已被證明能抑制TLR-4表達，從而抑制小膠質(zhì)細胞活化發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]，并有研究顯示黃柏堿的免疫抑制[13]、抗氧化、神經(jīng)保護作用[14]強于小檗堿，但黃柏堿對小膠質(zhì)細胞活化的影響及其機制還未有研究涉及。本實驗通過LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化，建立神經(jīng)炎癥模型，采用黃柏堿進行干預(yù)觀察其對小膠質(zhì)細胞的作用并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 小膠質(zhì)細胞BV2細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑DMEM/F-12高糖培養(yǎng)液（美國Gibco公司，批號：8119395）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：42A0378K）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司，批號：8117157）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Sigma公司，批號：M2128）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0015L）；NO試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：011020200601）；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（Sigma公司，批號：L2880）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）（美國Proteintech公司，批號：00080373）；環(huán)氧化酶-2（COX-2）（美國Proteintech公司，批號：10003388）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（美國Proteintech公司，批號：00077108）；Toll樣受體-4（TLR-4）（美國Proteintech公司，批號：10003388）；髓樣分化因子（MYD-88）（美國Proteintech公司，批號：10006278）；NF-κB p65抗體（美國Proteintech公司，批號：00084200）；二抗兔（福麥斯生物技術(shù)有限公司，批號：2635054）；二抗鼠（博士德公司，批號：BA1050）；ECL化學(xué)發(fā)光劑（Biosharp公司，批號：DCM70080100）；Resatorvid（美國MCE公司，貨號：HY-11109）；黃柏堿（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-20052104）。

1.3 主要儀器AC2-4S1型生物安全柜（新加坡ESCO公司）；C150型CO2培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）；CKX4I型三目倒置顯微鏡（美國Bio-rad公司）；ELX800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；DW FL450型低溫生物冰箱（中科美菱公司）；04313849512免疫印跡電泳及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-rad公司）；CHEMZDOCX RS+型IMage Lab凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Tek公司）；UCX-130型超聲波細胞破碎儀（美國SONICS公司）；MK10E型干式加熱型恒溫器（上海滬奧明公司）；BX43型正置熒光顯微鏡（日本OLMPUS公司）；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器（北京Vortex-Genie公司）；CFL-10002型恒溫水浴鍋（常州蒙特儀器公司）；Gen Pure Pro型超凈純水儀（美國Thermo公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)BV2細胞用內(nèi)含10%胎牛血清、1%鏈霉素、兩性霉素及青霉素、90%DMEM/F-12高糖培養(yǎng)液置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至鋪滿皿底90%時，用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代，并選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4.2 藥品配制 在無菌生物安全箱中操作，粉末狀20 mg的黃柏堿單體先用少量DMSO（保證使用濃度內(nèi)96孔板中每孔DMSO質(zhì)量分數(shù)＜1‰）溶解，再加入含血清的DMEM/F-12溶液稀釋成濃度為300 mmol/L黃柏堿單體溶液在-20℃冰柜中存儲備用。

1.4.3 造模濃度選擇及細胞分組 根據(jù)不同濃度脂多糖（LPS）在倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài)變化及NO水平結(jié)果，以及查閱文獻[17-18]選取1 μg/mL脂多糖（LPS）作為造模濃度。

實驗分組：對照組、模型組（LPS 1 μg/mL）、抑制劑組（Resatorvid，TLR-4抑制劑終濃度為100 μmol/L+LPS 1 μg/mL）、黃柏堿低劑量組（黃柏堿終濃度100 μmol/L+LPS 1 μg/mL）、黃柏堿中劑量組（黃柏堿終濃度200 μmol/L+LPS 1 μg/mL）、黃柏堿高劑量組（黃柏堿終濃度300 μmol/L+LPS 1 μg/mL）。細胞按預(yù)設(shè)組鋪板孵育細胞長至鋪滿皿底80%時，棄去各組原培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)基，在黃柏堿低、中、高劑量組內(nèi)加入不同劑量黃柏堿、抑制劑（Resatorvid）預(yù)保護細胞2 h，后于模型組，抑制劑組及黃柏堿低、中、高劑量組內(nèi)分別加入1 μg/mL LPS損傷24 h，最后進行各項指標檢測。

1.4.4 MTT法檢測黃柏堿、LPS、黃柏堿+LPS、抑制劑+LPS對BV2細胞活性的影響 選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化，離心重懸計數(shù)，混勻后鋪于96孔板中，每孔目標數(shù)取8×103個，每孔加入100 μL細胞混懸液，待細胞長至鋪滿皿底80%時進行實驗，吸出原培養(yǎng)液，加入不同濃度黃柏堿（10、50、100、200、300、500 μmol/L）或LPS（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL）或“1.4.3”各組別，在LPS損傷24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄原培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，置振蕩儀上避光震蕩10 min，使用酶標儀測定OD490值，計算各組細胞存活率。細胞存活率（%）=處理組OD值/空白組OD值×100%。

1.4.5 倒置相差顯微鏡下觀察各組BV2的形態(tài)變化 選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化，離心重懸計數(shù)，混勻后鋪于96或12孔板后，按照不同分組加入不同質(zhì)量濃度LPS（0.1、0.2、0.5、1.5 μg/mL）或“1.4.3”各組別，實驗前后用倒置相差顯微鏡（×400）下觀察各組小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化。

1.4.6 Griess法測定NO水平BV2細胞以1×105個/mL的密度接種于12孔板，1 mL/孔。待細胞貼壁后，設(shè)立對照組、不同質(zhì)量濃度LPS（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL）組或“1.4.3”各組別。LPS刺激BV2細胞24 h后收集細胞上清。按50 μL/孔的標準，在酶標板中加入各組細胞上清及標準品，再向各孔加入已靜置到室溫的50μL Griess ReagentⅠ和50μL Griess ReagentⅡ。振蕩混勻后避光反應(yīng)10 min，酶標儀測定吸光度OD540值。樣品中NO含量根據(jù)測得的標準曲線確定。各組NO水平=處理組/空白組。

1.4.7 Western blotting法檢測炎癥及通路相關(guān)蛋白表達 將細胞接種于培養(yǎng)皿中，分組及藥物處理同“1.4.3”，待LPS損傷24 h后取出培養(yǎng)皿置冰上，用4℃的PBS洗3次，每次均吸盡清洗液，后加入100 μL蛋白裂解液（蛋白酶抑制劑∶RIPA原液∶磷酸酶抑制劑∶PMSF=1∶1 000∶10∶10）充分裂解15 min，將裂解后的混懸液移至1.5 mL EP管內(nèi)行超聲裂解3次，15 s/次，將EP管置于預(yù)冷4℃的離心機12 000 r/min離心15 min，取上清液并加入5×SDS上樣緩沖液，高溫蛋白變性10 min，以BCA蛋白濃度測定法測蛋白濃度，進行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜，將PDVF膜在室溫下置于5%的脫脂奶粉中搖床封閉1 h，剪膜后將各條帶置于一抗中4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，室溫下?lián)u床孵育二抗1 h，TBST洗膜10 min×3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，使用Image Lab軟件進行圖像分析。

1.4.8 免疫熒光法檢測黃柏堿對LPS誘導(dǎo)BV2細胞iNOS、NF-κB（p65）的表達及核定位情況 將圓形蓋玻片用75%酒精浸泡過夜，紫外線消毒30 min，放入12孔板內(nèi)。把BV2細胞懸浮液按10×104個/孔接種于12孔板內(nèi)的蓋玻片上，2 mL/孔，設(shè)置對照組，模型組，抑制劑組和黃柏堿低、中、高劑量組。細胞貼壁后棄上清，按照分組加入黃柏堿或抑制劑6 h，再加1 μg/mL LPS刺激12 h，用4%多聚甲醛固定30 min，加入1%Triton破膜30 min，每孔加入免疫熒光封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜，室溫復(fù)溫1 h，二抗常溫避光1 h，DAPI染色5 min，抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下采集圖片。使用Image J軟件進行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 26.0和GraphPad Prim軟件對數(shù)據(jù)進行分析和作圖，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗均服從正態(tài)分布，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。上述實驗均重復(fù)3遍以上。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測黃柏堿、LPS、黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞活性的影響 各濃度黃柏堿組BV2細胞活性與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見圖1）各濃度LPS組BV2細胞活性與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見圖2）各濃度黃柏堿+LPS組BV2細胞活性與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見圖3）表明選取的不同濃度黃柏堿、LPS對細胞活性均無損傷作用。

圖1 不同濃度黃柏堿對BV2細胞活性的影響（±s，n=3）

圖2 不同濃度LPS對BV2細胞活性的影響（±s，n=3）

圖3 不同濃度黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞活性的影響（s，n=3）

2.2 不同濃度LPS、黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞形態(tài)的影響

2.2.1 不同濃度LPS對BV2細胞形態(tài)的影響 對照組小膠質(zhì)細胞呈靜息狀態(tài)，胞體細長，胞體兩側(cè)伸出細長突起的分支，呈“分枝狀”；加入LPS刺激后，細胞大多數(shù)胞體變大、變圓，部分細胞表面突起變粗短，呈典型的“阿米巴狀”，尤其以LPS 1 μg/mL組、LPS 2 μg/mL組激活最充分。

圖4 不同濃度LPS對BV2細胞形態(tài)的影響（×400）

2.2.2 黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞形態(tài)的影響 對照組小膠質(zhì)細胞呈未激活的“分枝狀”；經(jīng)LPS 1 μg/mL刺激后，模型組細胞呈“阿米巴狀”；黃柏堿、抑制劑（resatorvid）預(yù)處理后細胞形態(tài)有改善，黃柏堿高劑量組、抑制劑組效果最好。（見圖5）

圖5 黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞形態(tài)的影響（×400）

2.3 不同濃度LPS、黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞NO水平的影響

2.3.1 不同濃度LPS對BV2細胞NO水平的影響 不同濃度LPS干預(yù)后，除LPS 0.1 μg/mL組外，其余各組BV2細胞的NO表達量均明顯高于對照組（P＜0.01），LPS 1 μg/mL組BV2細胞的NO表達量與LPS 2 μg/mL組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖6）

圖6 不同濃度LPS對BV2細胞NO水平的影響s，n=3）

2.3.2 黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞NO水平的影響LPS干預(yù)后，模型組BV2細胞NO表達量明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿預(yù)處理2 h后，各組BV2細胞NO表達量呈劑量依賴性降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明黃柏堿可抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞NO的釋放；黃柏堿低劑量組BV2表達量高于抑制劑組（P＜0.01）；黃柏堿中、高劑量組BV2細胞NO表達量與抑制劑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖7）

圖7 黃柏堿/抑制劑對BV2細胞NO水平的影響（=3）

2.4 Western blotting法檢測炎癥及通路相關(guān)蛋白表達結(jié)果

2.4.1 Western blotting法檢測各組BV2細胞炎癥蛋白表達情況 模型組BV2細胞iNOS、COX-2、TNF-α表達明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿干預(yù)后，表達量呈劑量依賴性降低，黃柏堿高劑量組BV2細胞iNOS、TNF-α，以及黃柏堿低、中、高劑量組BV2細胞COX-2明顯均低于模型組（P＜0.01）；黃柏堿低、中、高劑量組BV2細胞iNOS、COX-2，以及黃柏堿高劑量組TNF-α與抑制劑組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖8）

2.4.2 Western blotting法檢測各組BV2細胞通路蛋白表達情況 模型組BV2細胞TLR-4、MYD-88、p65表達均明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿干預(yù)后表達量呈劑量依賴性降低，黃柏堿中、高劑量組BV2細胞TLR-4、MYD-88、p65表達均明顯低于模型組（P＜0.01）；黃柏堿中、高劑量組BV2細胞TLR-4、p65，以及黃柏堿高劑量組BV2細胞MYD-88表達與抑制劑組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖8）

圖8 Western blotting法檢測各組BV2細胞炎癥及通路相關(guān)蛋白表達情況s，n=3）

2.5 黃柏堿對LPS誘導(dǎo)BV2細胞iNOS、NF-κB（p65）的表達及核定位的影響

2.5.1 黃柏堿對LPS誘導(dǎo)BV2細胞iNOS表達的影響 對照組BV2細胞的iNOS為淡綠色，細胞核呈藍色。LPS刺激后，模型組BV2細胞的顏色加深；黃柏堿、抑制劑（resatorvid）預(yù)處理后，顏色變淺。熒光定量結(jié)果表明，LPS處理后，模型組BV2細胞iNOS熒光表達明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿干預(yù)后，BV2細胞iNOS熒光表達呈劑量依賴性降低，黃柏堿中、高劑量組BV2細胞iNOS熒光表達與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；黃柏堿高劑量組BV2細胞iNOS熒光表達與抑制劑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖9～10）

圖9 各組iNOS熒光值比較s，n=3）

2.5.2 黃柏堿對LPS誘導(dǎo)BV2細胞活化NF-κB（p65）表達及核定位的影響 對照組BV2細胞的NF-κB（p65）聚集在胞漿中，淡紅色，細胞核藍色；LPS刺激后，模型組BV2細胞的NF-κB（p65）呈深紅色，熒光定量明顯高于對照組（P＜0.01），且大量進入細胞核（P＜0.01）；黃柏堿干預(yù)后，BV2細胞NF-κB（p65）熒光表達、核漿比呈劑量依賴性降低，黃柏堿中、高劑量組NF-κB（p65）熒光表達、核漿比明顯低于模型組（P＜0.05）；黃柏堿高劑量組BV2細胞NF-κB（p65）熒光表達、核漿比與抑制劑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖11～12）

圖11 免疫熒光法檢測各組小膠質(zhì)細胞NF-κB（p65）表達及核定位情況（×400）

圖10 免疫熒光法檢測各組小膠質(zhì)細胞iNOS表達（×400）

圖12 各組小膠質(zhì)細胞NF-κB（p65）表達及核漿比較s，n=3）

3 討 論

小膠質(zhì)細胞是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的單核巨噬細胞，占腦細胞總數(shù)的10%～15%。其功能主要有免疫監(jiān)視、吞噬病原體、分泌細胞因子、抗原提呈及修復(fù)組織等。靜息時，胞體小，有伸向各個方向的突起，為“分枝狀”的小膠質(zhì)細胞；在受到腦內(nèi)不同信號刺激后，其轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚偷男∧z質(zhì)細胞，胞體增大，突起變短、類似于“圓形”，此時的小膠質(zhì)細胞不具有吞噬功能，其在一定條件下轉(zhuǎn)化后，呈“阿米巴狀”，擁有細胞吞噬功能，稱之為活化型小膠質(zhì)細胞。活化的小膠質(zhì)細胞形態(tài)不同，作用不同，通過向不同的方向極化來完成生物學(xué)功能，主要極化為兩種類型，即“經(jīng)典活化”M1型和“替代活化”M2型。M1極化后介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中扮演重要角色。LPS或者IFN-γ，使小膠質(zhì)細胞向M1型極化，表達促炎性細胞因子；IL-4/IL-13使小膠質(zhì)細胞向M2型極化，抑制炎癥和恢復(fù)體內(nèi)平衡狀態(tài)。有研究表明，中藥可以通過多條通路來誘導(dǎo)向M2型極化[19]。

小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間關(guān)系微妙，可以保護神經(jīng)元，亦能損傷神經(jīng)元。在靜息狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞可通過釋放神經(jīng)生長因子營養(yǎng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，通過吞飲來清除中樞神經(jīng)發(fā)育過程中的凋亡細胞和代謝產(chǎn)物以維持組織穩(wěn)定；同時作為免疫細胞，小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)宿主抵御病原體的第一道防線，將健康組織與受損區(qū)域隔開。但是小膠質(zhì)細胞的慢性激活、過度激活會通過釋放大量氧自由基及神經(jīng)毒性因子，如一氧化氮（NO）、促炎細胞因子、活性氧中間體、趨化細胞因子等導(dǎo)致神經(jīng)損傷[20]。其中，TNF-α能夠與神經(jīng)元上的TNF受體結(jié)合，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）依賴的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，或促進谷氨酸釋放，增加興奮性毒性，此過程伴隨Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLR）的激活，引起炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)，使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）等的表達增加，加重神經(jīng)炎癥。故小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間聯(lián)系可能是通過TLR4/NF-κB通路實現(xiàn)的[21]。

體外實驗中，不同狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞由不同的潛在配體刺激得到。其中TLR激動劑，諸如LPS、IFN-γ可將小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)活化，作為神經(jīng)炎癥反應(yīng)模型，也稱M1型。LPS為革蘭陰性菌外壁的組成部分，通過TLR4將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)，并通過兩種途徑，髓樣分化初級應(yīng)答（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88）依賴性和MyD88非依賴性，激活NF-κB。TLR4是Toll樣受體家族（toll-like receptors，TLRs）的一員，Toll受體是Ⅰ型跨膜蛋白，它們可活化胞內(nèi)信號分子，進而活化NF-κB，導(dǎo)致細胞黏附分子、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和NO合成酶等基因的表達。

本研究中NO測定、Western blotting、免疫熒光實驗結(jié)果表明，黃柏堿可抑制由LPS誘導(dǎo)的BV2細胞活化，抑制NO的釋放，抑制iNOS、COX-2、TNF-α的表達，其作用可能是通過抑制TLR-4/MYD-88/NF-κB（p65）通路實現(xiàn)的，進而抑制炎癥因子分泌。這為臨床上應(yīng)用黃柏治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供了實驗依據(jù)。