殼寡糖對(duì)泡菜品質(zhì)、微生物多樣及演替規(guī)律的影響

谷新晰，王晨笑，于宏偉，亢春雨，桑亞新，孫紀(jì)錄

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000）

泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因富含膳食纖維、有機(jī)酸、較好的風(fēng)味及較長(zhǎng)的貨架期而被世界各地消費(fèi)者所喜愛[1-3]。隨著消費(fèi)者膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，泡菜的保健功能的進(jìn)一步挖掘，泡菜消費(fèi)量必將不斷增加。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，2019年全球泡菜市場(chǎng)總值達(dá)為217 億元，預(yù)計(jì)2026年可以增長(zhǎng)到310 億元。泡菜的生產(chǎn)和品質(zhì)很大程度上取決于泡菜中微生物群落和發(fā)酵條件的控制。泡菜中的乳酸菌通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、維生素及有益化合物等物質(zhì)，并最終影響泡菜的保質(zhì)期，風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分等感官品質(zhì)特征[4]。泡菜中亞硝酸鹽含量一直被消費(fèi)者所關(guān)注，亞硝酸鹽是一類對(duì)人類有毒性的無機(jī)化合物，蔬菜和腌肉一般是飲食中硝酸鹽和亞硝酸鹽的主要來源[5]。我國(guó)頒布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》（GB 2762-2017）[6]中規(guī)定腌制菜中亞硝酸鹽的最大限量為20 mg/kg。如何保障泡菜產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展成為當(dāng)務(wù)之急。

微生物在泡菜發(fā)酵中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，最終影響泡菜的總體風(fēng)味[7-8]。目前，人們已揭示泡菜菌群，如泡菜中主要為乳桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬和小球菌屬等[9-11]，也有一些研究報(bào)道泡菜中存在魏斯氏屬、乳球菌屬[12-13]。在自然發(fā)酵生產(chǎn)過程中，由于發(fā)酵條件、原料質(zhì)量及設(shè)備等因素的影響，泡菜生產(chǎn)過程易受來自環(huán)境微生物的污染[14]，威脅了泡菜食品的安全，如過高的亞硝酸鹽含量及有害微生物的存在[10]。大量研究表明，泡菜中的亞硝酸鹽主要是由于植物組織中的硝酸鹽被微生物中的硝酸鹽還原酶還原為亞硝酸鹽而來[15-17]。蔬菜本身的硝酸鹽含量及發(fā)酵過程總微生物的作用共同決定泡菜最終的亞硝酸鹽含量。目前大多采用接種特定的菌株[11]，控制較低的發(fā)酵溫度[7]及食鹽含量[18]來達(dá)到對(duì)泡菜發(fā)酵過程的控制。雖然上述方法取得一定的效果，但是泡菜品質(zhì)存在一定的缺陷。尋求便捷的泡菜生產(chǎn)控制方法意義重大。

殼寡糖（Chitosan oligosaccharide）是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一呈堿性、帶正電荷的低聚糖[19]。2014年我國(guó)批準(zhǔn)其為新食品原料。大量研究表明殼寡糖能夠活化乳酸菌等人體腸道內(nèi)的有益菌群，抑制有害菌，維持腸道菌群平衡。益生元是一種可以被宿主微生物選擇性利用，從而改善宿主健康的基質(zhì)[20]。添加益生元的發(fā)酵食品，不僅可以滿足消費(fèi)者對(duì)健康食品的訴求，還可提升產(chǎn)品的附加值，增加益生元的應(yīng)用領(lǐng)域[21-23]。殼寡糖屬于益生元，具有促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害微生物生長(zhǎng)的作用，然而，到目前為止，殼寡糖在泡菜中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。泡菜發(fā)酵過程中微生物菌落的演替及其與益生元的關(guān)系尚不清楚。

本文研究殼寡糖對(duì)泡菜安全指標(biāo)和理化指標(biāo)的影響，通過高通量測(cè)序技術(shù)探討殼寡糖對(duì)菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，解析殼寡糖泡菜中微生物的變化規(guī)律，為殼寡糖在泡菜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼寡糖（Mw＜1 500 u，脫乙酰度≥90%），山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司；白蘿卜市售；亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸（均為分析純級(jí)），天津市福晨化學(xué)試劑廠；酚酞、氫氧化鈉、鹽酸萘乙二胺、硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅（均為分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，LB 液體培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基，索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3DW 微機(jī)型酸度計(jì)，合肥橋斯設(shè)備制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；721G 可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；CR-400 色差計(jì)，柯尼卡美能達(dá)公司；NDJ-5S 數(shù)字黏度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制備及樣品的收集 泡菜腌制流程如圖1所示。將白蘿卜除去須根，洗凈瀝干后切成1 cm×1 cm×1 cm 的小塊，放入滅菌的壇子中，加入殼寡糖，使其質(zhì)量濃度分別為0，2.5，5，10 g/L，再加入50 g/L 的鹽水，混合均勻，室溫條件下自然發(fā)酵。發(fā)酵0，1，3，5，7，10 d 和15 d 取樣。為了保證樣品的均勻性和代表性，分別在發(fā)酵罐和浸泡罐的上、中部和下部采集鹵水樣品，混合，貯藏于-80℃冰箱，備用。

圖1 泡菜制作流程Fig.1 The fermentation process of pickles

1.3.2 亞硝酸鹽的測(cè)定 樣品中亞硝酸含量的測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺法。具體步驟參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定 鹽酸萘乙二胺法》（GB5009.33-2016）。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定 樣品中氨基態(tài)氮的含量采用甲醛值法測(cè)定，具體步驟參考按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 《飲料通用分析方法》（GB/T 12143-2008）。

1.3.4 總酸的測(cè)定 參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 《食品中總酸的測(cè)定》（GB/T 12456-2008）測(cè)定發(fā)酵液中的總酸含量。

1.3.5 泡菜中微生物區(qū)系的測(cè)定 對(duì)照組是自然發(fā)酵泡菜，發(fā)酵0，1，3，5，7 d，定時(shí)取樣，編號(hào)是NC0d、NC1d、NC3d、NC5d 和NC7d。試驗(yàn)組為添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%殼寡糖的發(fā)酵泡菜，在發(fā)酵1，3，5 d和7 d 取樣，編號(hào)為MC1d、MC3d、MC5d 和MC7d。將樣品置于-80 ℃冰箱，用于樣品中總DNA 的提取分析。

采集泡菜汁100 mL，選用改進(jìn)的CTAB 法[24]提取樣品總DNA，采用NEB 公司的Q5 高保真DNA 聚合酶擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 的V3～V4 區(qū)域。細(xì)菌515F 引物：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，細(xì)菌515 引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴(kuò)增體系（25 μL）：5×反應(yīng)緩沖液5 μL，5×GC 緩沖液5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正向引物（10 μmol/L）1μL，反向引物 （10 μmol/L）1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，DNA 聚合酶0.25 μL。擴(kuò)增參數(shù)：預(yù)變性98 ℃，2 min；變性98 ℃，30 s；退火55℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；30 個(gè)循環(huán)，終延伸72℃，5 min。采用AXYGEN 公司的凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。將PCR 擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA 檢測(cè)試劑盒，定量?jī)x器為酶標(biāo)儀（BioTek，F(xiàn)Lx800）。采 用Illumina 公司 的TruSeq Nano DNA LT 文庫(kù)制備試劑盒制備測(cè)序文庫(kù)，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina Miseq/NovaSeq 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端 （Pairedend）測(cè)序。

使用MOTHUR 軟件包分析數(shù)據(jù)，讀取小于150 bp 的序列，從數(shù)據(jù)集中刪除低質(zhì)量序列，并用QIIME 軟件 （Quantitative Insights Into Microbial Ecology，version 1.8.0）區(qū)分和刪除嵌合體，選用Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）對(duì)序列進(jìn)行門和屬水平注釋分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 每次試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，利用Excel 2010 和SPSS19.0 軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，以P＜0.05 為差異顯著，以P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)泡菜中亞硝酸鹽含量、總酸、pH 值和氨基酸態(tài)氮的影響

亞硝酸鹽含量是發(fā)酵蔬菜制品安全性的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖對(duì)泡菜發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量影響顯著，結(jié)果見表1。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，4 種泡菜的亞硝酸鹽含量變化存在差異。殼寡糖添加量為0.25%的泡菜與自然發(fā)酵制備的泡菜亞硝酸鹽含量都在第3 天出現(xiàn)峰值，而其含量?jī)H為后者的50%左右。殼寡糖添加量為0.5%和1%的泡菜中亞硝酸鹽峰值向后推遲2 d。殼寡糖作為益生元具有抑制有害菌生長(zhǎng)和促進(jìn)特定乳酸菌生長(zhǎng)的作用。這可能是由于發(fā)酵后期隨著乳酸菌的生長(zhǎng)，在H+的作用下，NO2-被還原成NO，從而降低了亞硝酸鹽含量。

表1 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽等物質(zhì)含量的變化Table 1 The content of nitrite and other substances during the fermentation process of pickles samples

（續(xù)表1）

對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程中總酸含量的測(cè)定表明：殼寡糖對(duì)泡菜發(fā)酵中的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生一定的影響。發(fā)酵3 d 時(shí)，添加殼寡糖的3 種泡菜的總酸含量遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，并且3 種泡菜總酸含量達(dá)到6.5 g/kg 后增加緩慢，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)4 種泡菜的總酸含量：1%殼寡糖＞0.5%殼寡糖＞0.25%殼寡糖＞對(duì)照。其原因很可能是因添加殼寡糖促進(jìn)了泡菜中乳酸菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)了乳酸菌的次級(jí)代謝，使得總酸含量較高。發(fā)酵過程中pH 值的變化規(guī)律與總酸的變化規(guī)律一致：pH 值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，當(dāng)pH 值達(dá)3.3 后逐漸趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束的pH 值保持在3.0 左右。未添加COS 的對(duì)照泡菜pH 值在發(fā)酵初期下降緩慢，其它3 種泡菜的pH值發(fā)酵前5 d 迅速下降。上述結(jié)果表明泡菜樣品pH 值受有機(jī)酸含量的影響。

氨基酸態(tài)氨（AN）為蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，其主要來自原料中蛋白質(zhì)成分的水解和微生物自溶，它能使食品鮮味柔和，增進(jìn)色澤，調(diào)和香氣，因此成為評(píng)價(jià)調(diào)味食品質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)，在發(fā)酵食品的分析中具有重要意義。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，4 種泡菜的氨基酸態(tài)氮含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，第10 天達(dá)到最大值后趨于穩(wěn)定。同時(shí)，泡菜中氨基態(tài)氮含量也隨殼寡糖量的增加而增加，當(dāng)殼寡糖添加量為1%時(shí)，泡菜中的氨基態(tài)氮含量較對(duì)照組提升39%。

2.2 殼寡糖對(duì)泡菜自然發(fā)酵中細(xì)菌群落的影響

2.2.1 泡菜細(xì)菌菌落多樣性分析 添加殼寡糖對(duì)泡菜發(fā)酵過程中微生物的α 多樣性指數(shù)的影響見表2。經(jīng)測(cè)定，9 個(gè)樣品完整性參數(shù)覆蓋范圍數(shù)值在99.6%～99.99%之間，變化幅度均大于0.999，表明本次測(cè)序結(jié)果可用于后續(xù)樣品的微生物多樣性分析。

表2 泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of bacterial diversity during pickles sample fermentation

總體而言，添加殼寡糖對(duì)泡菜微生物的豐富度有較大影響，并在泡菜的發(fā)酵不同階段表現(xiàn)出一定的差異。未添加殼寡糖的對(duì)照組微生物豐富度Chao 1 指數(shù)在整個(gè)發(fā)酵階段都降低，而ACE指數(shù)在整個(gè)過程中也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，這兩個(gè)多樣性指數(shù)分別從254.2 降至66.00，從253.59 降至72.06，說明自然發(fā)酵過程中微生物總的豐富程度降低，其原因主要是因發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物對(duì)發(fā)酵無關(guān)微生物的抑制所致。添加殼寡糖試驗(yàn)組的ACE 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)最終也呈降低趨勢(shì)，在整個(gè)過程中有一定的波動(dòng)，如發(fā)酵1 d 后，試驗(yàn)組的ACE 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)分別由253.59，254.2 增至352.28，354.5。除發(fā)酵3 d 的結(jié)果外，整個(gè)發(fā)酵過程中試驗(yàn)組的上述兩個(gè)指數(shù)都高于照組，說明添加殼寡糖增強(qiáng)了泡菜發(fā)酵過程中菌群的豐富程度，為泡菜品質(zhì)提升提供一定的保障。為進(jìn)一步分析兩組試驗(yàn)發(fā)酵過程中多樣性的變化規(guī)律和差異，本研究開展微生物多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)）分析，其中Simpson 指數(shù)值越大，微生物群落的多樣性越低；而Shannon值越大，微生物群落的多樣性越高。經(jīng)分析，添加殼寡糖顯著降低了泡菜發(fā)酵各階段中的微生物多樣性。如發(fā)酵3 d 時(shí)，較對(duì)照組發(fā)酵的Shannon 指數(shù)降低0.6，隨后兩者差值雖有所減少，但差值維持在0.4 范圍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，添加殼寡糖對(duì)發(fā)酵各階段的多樣性都產(chǎn)生一定的影響。

泡菜發(fā)酵過程中的微生物多樣性指數(shù)先減后增，而兩組試驗(yàn)有一定差異，如對(duì)照組中的Shannon 在發(fā)酵3 d 達(dá)到最大值，添加殼寡糖的試驗(yàn)組則在發(fā)酵5 d 達(dá)到最大值，分析其原因可能由于殼寡糖屬于益生元物質(zhì)，會(huì)對(duì)特定的微生物（泡菜中的優(yōu)勢(shì)菌乳酸菌）有較好的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，對(duì)有害菌則表現(xiàn)出抑制作用，乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)的積累影響了細(xì)菌群落多樣性。

2.2.2 泡菜發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 泡菜各階段樣品中的微生物門水平統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見圖2。從泡菜樣品中共檢出變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和其它（others）7類，它們?cè)诓煌l(fā)酵時(shí)期的相對(duì)含量存在交替性變化。對(duì)照組和試驗(yàn)組中的微生物在門水平上表現(xiàn)出類似規(guī)律，如在發(fā)酵前期，變形菌門一直占據(jù)統(tǒng)治地位，發(fā)酵中期時(shí)厚壁菌門類數(shù)量迅速增加，其相對(duì)含量與變形菌數(shù)量類似。除此之外，添加殼寡糖改變了原有微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和相對(duì)含量。對(duì)比發(fā)酵前期（1 d）發(fā)現(xiàn)，殼寡糖促進(jìn)了藍(lán)藻菌門和厚壁菌門微生物數(shù)量，同時(shí)使變形菌門數(shù)量減少。隨著發(fā)酵的進(jìn)行（3 d），殼寡糖對(duì)后壁菌門微生物的促進(jìn)作用越加明顯，使兩組試驗(yàn)中后壁菌門微生物數(shù)量相差10%左右，同時(shí)殼寡糖抑制此階段放線菌門微生物的生長(zhǎng)。對(duì)比分析發(fā)酵5 d 和7 d中微生物菌群結(jié)構(gòu)可知，添加殼寡糖泡菜組中的菌群不再發(fā)生改變，即發(fā)酵第5 天完成發(fā)酵，而對(duì)照組中微生物仍在發(fā)生變化，如放線菌門相對(duì)含量增加約3 倍，而對(duì)照組中后壁菌門相對(duì)含量減少。

圖2 泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落門水平分布Fig.2 Bacterial community phylum level distribution during pickle fermentation

兩組樣品發(fā)酵過程中微生物屬水平分析結(jié)果如圖3所示。共發(fā)現(xiàn)17 個(gè)屬微生物參與發(fā)酵過程，它們的協(xié)同作用賦予泡菜特色風(fēng)味。

圖3 泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落屬水平分布Fig.3 Bacterial community genus level distribution during pickle fermentation

殼寡糖改變了泡菜發(fā)酵過程中的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。整體來看，添加殼寡糖減少了泡菜中微生物種類、數(shù)量，這個(gè)現(xiàn)象伴隨泡菜的整個(gè)發(fā)酵過程。殼寡糖在發(fā)酵初期影響不顯著，試驗(yàn)組和對(duì)照組的主要菌屬均是假單胞菌屬（78.67%～84.91%）。相關(guān)研究表明假單胞菌屬在自然界氮素循環(huán)過程中，尤其是反硝化過程中發(fā)揮著重要的作用，該菌屬微生物與亞硝酸鹽含量變化有關(guān)。結(jié)合發(fā)酵過程中亞硝酸含量變化規(guī)律，可初步推測(cè)添加殼寡糖不能直接降低泡菜中亞硝酸鹽的最初生成量。隨著泡菜發(fā)酵的推進(jìn)，殼寡糖對(duì)泡菜中微生物區(qū)系的影響凸顯出來。發(fā)酵中期（3 d），對(duì)照組發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌（微小桿菌屬） 被乳球菌屬所取代，兩組泡菜中的微生物種群數(shù)目也出現(xiàn)較大變化，即對(duì)照發(fā)酵組中的14 種屬微生物減少為9種，這表明殼寡糖在泡菜中發(fā)揮了益生元作用，促進(jìn)了泡菜中乳酸菌的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制了其它菌的生長(zhǎng)，這可能是相應(yīng)時(shí)期的亞硝酸鹽含量降低及品質(zhì)提升的主要原因。對(duì)照發(fā)酵樣品在此階段有6 個(gè)屬微生物相繼參與發(fā)酵，分別是明串珠菌屬（12.02%）、嗜冷桿菌屬（11.43%）、芽孢桿菌屬（2.37%）、歐文氏菌屬（2.34%）、乳球菌屬（0.73%）和魏斯式菌屬（0.13%）。發(fā)酵5 d 后，對(duì)照發(fā)酵樣品中的泛菌屬和明串球菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌，而添加殼寡糖的試驗(yàn)組中乳球菌占有主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，隨后才是泛菌屬和明串珠球菌屬，相應(yīng)的菌群持續(xù)到發(fā)酵末期（7 d）。樣品NC5d 和樣品NC7d 中優(yōu)勢(shì)菌群均為明串珠菌屬（25.78%～26.09%），成團(tuán)泛菌屬（20.41%～24.62%）、歐文氏菌屬（2.47%～4.95%）、乳球菌屬（1.60%～2.01%）和魏斯式菌屬（0.64%～1.28%）含量均增加，說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，泡菜中乳酸菌含量占據(jù)很大優(yōu)勢(shì)，而嗜冷桿菌屬（4.55%～5.08%）和芽孢桿菌屬（0.42%～1.07%）含量下降。

2.2.3 泡菜細(xì)菌樣本的比較分析 為研究不同發(fā)酵時(shí)間泡菜樣本的相似性和差異，根據(jù)Beta 多樣性距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類，使用非加權(quán)組平均法算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，樣本間的距離越大，細(xì)菌群落差異越大。

根據(jù)泡菜發(fā)酵過程中菌群的特征 （圖4），將泡菜發(fā)酵過程大體分為3 個(gè)階段，分別是早期（0～1 d），發(fā)酵中期（2～3 d）和發(fā)酵末期（4～7 d）。添加殼寡糖改變了泡菜原有微生物的演替規(guī)律，發(fā)酵早期，殼寡糖對(duì)泡菜中微生物的影響不明顯，它們可被劃分為一個(gè)分支。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，殼寡糖對(duì)泡菜中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響加劇，表現(xiàn)為與之平行的另一支微生物菌群。屬水平分析結(jié)果表明，添加殼寡糖加速了泡菜中微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的變化，促進(jìn)了泡菜品質(zhì)的成熟。

圖4 泡菜細(xì)菌聚類分析Fig.4 Cluster analysis of bacterial in pickle

2.2.4 泡菜細(xì)菌物種與環(huán)境因子的相關(guān)性分析從圖5可看出，泛菌屬受pH 和總酸（ZS）的影響非常顯著（P≤0.001），pH 呈負(fù)相關(guān)，總酸呈正相關(guān)；假單胞菌屬、水螺菌屬、藍(lán)細(xì)菌屬受pH、總酸和氨基酸態(tài)氮的影響較顯著（0.001＜P≤0.01），pH呈正相關(guān)，總酸和氨基酸態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)。嗜冷桿菌屬受亞硝酸鹽（YXSY）的影響較顯著（0.001＜P≤0.01），呈正相關(guān)。艾克曼菌受pH 值的影響顯著（0.01＜P≤0.05），呈正相關(guān)。芽孢桿菌屬、微小桿菌屬、明串珠菌屬受亞硝酸鹽的影響顯著（0.01＜P≤0.05），呈正相關(guān)。歐文氏菌屬、乳球菌屬受總酸、氨基酸態(tài)氮的影響顯著 （0.01＜P≤0.05），呈正相關(guān)。

圖5 泡菜中25 種細(xì)菌物種與環(huán)境因子在屬水平上的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis at genus level between bacterial 25 species and environmental factors during pickle fermentation

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖對(duì)泡菜中亞硝酸鹽含量和峰值出現(xiàn)的時(shí)間有不同程度的影響，如殼寡糖能夠?qū)Ξa(chǎn)生硝酸鹽還原酶的微小桿菌屬微生物進(jìn)行有效抑制，同時(shí)促進(jìn)可降解亞硝酸鹽的乳球菌屬微生物的生長(zhǎng)。

泡菜發(fā)酵的主要微生物為乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等乳酸菌，也有一些研究報(bào)道了魏斯氏屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus），這些研究結(jié)果大多基于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)而獲得，一些微生物被遺漏。本研究利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)泡菜發(fā)酵過程中有一些非乳酸菌菌群，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和擬桿菌屬（Bacteroides）等。這些非乳酸菌細(xì)菌在自然界氮素循環(huán)過程中起作用，因此很可能在泡菜的氨基酸態(tài)氮的生成、亞硝酸鹽產(chǎn)生和降解中發(fā)揮著重要的作用[25-28]。殼寡糖對(duì)泡菜過程中的微生物區(qū)系影響極大，尤其在發(fā)酵中、后期乳球菌屬、泛菌屬和明串珠菌屬的含量差異最為顯著。本研究結(jié)果表明，殼寡糖促進(jìn)乳球菌屬微生物生長(zhǎng)作用非常明顯，在發(fā)酵中后期（3～7 d）菌群豐度幾乎可以占到總量的50%左右，而自然發(fā)酵組中的優(yōu)勢(shì)菌是明串珠菌屬（約23%）。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，全面分析了在殼寡糖存在下，泡菜發(fā)酵過程中微生物群落變化及演替規(guī)律，同時(shí)研究了殼寡糖對(duì)泡菜樣品亞硝酸鹽、總酸以及氨基態(tài)氮含量的影響。結(jié)果表明，殼寡糖對(duì)了發(fā)酵環(huán)境中的菌群豐度和結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生了顯著影響，殼寡糖（0.5%添加量）試驗(yàn)組在發(fā)酵1 d 時(shí)，菌群豐度最高；雖然殼寡糖的添加沒有在門的水平改變泡菜發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)，但在屬水平上有顯著變化，隨著發(fā)酵進(jìn)入中后期，殼寡糖實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌為乳球菌屬，并非對(duì)照組的成團(tuán)泛菌屬、明串珠菌屬等；添加殼寡糖（1%添加量）發(fā)酵15 d后，使得泡菜中亞硝酸鹽含量降低了約50%，總酸含量增加了87%，氨基酸態(tài)氮含量提高了32%。研究表明，殼寡糖應(yīng)用于泡菜發(fā)酵，可以起到對(duì)乳球菌屬微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，同時(shí)提升產(chǎn)品風(fēng)味，也助于對(duì)發(fā)酵過程中微生物指標(biāo)的控制，是一種有助于提升泡菜產(chǎn)品品質(zhì)的發(fā)酵方式。