河水添加對櫛孔扇貝生理和免疫指標(biāo)的影響

李長青 車建鋒 崔玉龍 鄒戰(zhàn)明 黃二帥 盧龍飛 常麗榮

摘要：為探究河水注入養(yǎng)殖海域?qū)笨咨蓉惖挠绊?，挑選山東省榮成市愛蓮灣海域的養(yǎng)殖扇貝為試驗(yàn)對象，研究其在毗鄰河水（0、10%、20%、30%、50%）添加后存活率、耗氧率、排氨率、SOD活性及重金屬含量的變化。在試驗(yàn)過程中，0、10%、20%河水添加組存活率均≥95%，30%河水添加組存活率為91%，50%河水添加組櫛孔扇貝于120 h時(shí)全部死亡;在1～48 h間，10%、20%、30%河水添加組櫛孔扇貝的耗氧率、排氨率和閉殼肌SOD活性均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，并在120 h后逐漸趨于穩(wěn)定。50%河水添加組櫛孔扇貝的耗氧率、排氨率和閉殼肌SOD活性持續(xù)最低（P<0.05）。在試驗(yàn)結(jié)束（336 h）時(shí)，10%河水添加組耗氧率顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05），排氨率和閉殼肌SOD活性略高于0、20%河水添加組（P>0.05）。30%河水添加組耗氧率、排氨率和閉殼肌SOD活性顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05）;試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組櫛孔扇貝體內(nèi)的Pb、Cr、Hg、As含量均有提高，顯著高于無（0）河水添加組。

關(guān)鍵詞：櫛孔扇貝;河水;耗氧率;排氨率;重金屬;免疫指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S944.4+3;S968.31?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0172-05

收稿日期：2021-03-18

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0900703）;山東省泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程高效生態(tài)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新類項(xiàng)目（編號(hào)：LJNY201816）。

作者簡介：李長青（1967—），男，山東威海人，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與增殖研究。E-mail：592378772@qq.com

通信作者：常麗榮，碩士研究生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品加工研究。E-mail：xs-chengguo@163.com。

櫛孔扇貝（Chlamys farreri）主要產(chǎn)于山東半島及遼寧大連周邊海域[1]，是我國北方沿海貝類養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類，其肉質(zhì)鮮美，深受人們的喜愛。然而，近年來環(huán)境因子的變化，致使養(yǎng)殖貝類品質(zhì)和產(chǎn)量下降，制約了貝類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。已有學(xué)者探究了溫度、鹽度、pH值、溶解氧含量、營養(yǎng)鹽含量等對貝類生理代謝和免疫能力的影響[3-8]，其中鹽度是影響貝類生長存活的重要環(huán)境因子[9-10]。鹽度的變化不僅會(huì)對貝類的呼吸和攝食活動(dòng)產(chǎn)生影響，還會(huì)影響體內(nèi)免疫酶的活性，進(jìn)而影響貝類的生長及存活[11-13]。貝類作為變滲透壓動(dòng)物，對海水鹽度的適應(yīng)具有一定范圍，能根據(jù)鹽度調(diào)節(jié)自身滲透壓，從而保持正常的生命活動(dòng);但超出適應(yīng)范圍，貝類不能將其雙殼完全關(guān)閉，并且其自身血淋巴滲透壓調(diào)節(jié)具有一定的延遲性，不能維持正常的生理代謝[14]。胡益鳴等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度對巖牡蠣的存活和免疫指標(biāo)影響具有顯著的差異，適宜巖牡蠣存活的鹽度為2.0%～3.6%[15]。聶鴻濤等報(bào)道了在鹽度2.0%～4.0%之間，耗氧率隨著鹽度的升高先減少后增加，排氨率隨著鹽度的升高先增加后減少[16]。因此，研究鹽度脅迫這一環(huán)境因子對櫛孔扇貝生理和免疫指標(biāo)的影響，有助于人們了解櫛孔扇貝的逆境適應(yīng)機(jī)制。

扇貝養(yǎng)殖主要集中在淺海，夏季持續(xù)的高溫和降雨導(dǎo)致地表徑流增加，會(huì)引起近岸海域鹽度的大幅度變化[17]。地表徑流匯入河槽，流入大海，在改變鹽度的同時(shí)，水體中可能混有營養(yǎng)鹽和重金屬等成分[18-20]，很可能對近岸扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)生影響。然而，河水對貝類影響的相關(guān)探究并未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)探究海水中添加河水對櫛孔扇貝生理和免疫指標(biāo)的影響，以期為近岸櫛孔扇貝健康養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用櫛孔扇貝取自威海長青海洋科技股份有限公司的愛蓮灣近岸養(yǎng)殖海域，選取殼長、個(gè)體質(zhì)量基本一致的櫛孔扇貝作為試驗(yàn)個(gè)體，扇貝初始?xì)らL平均為（46.79±4.35） mm，個(gè)體質(zhì)量為（11.25±3.42） g;河水取自該海域的車道河中上游，以保證試驗(yàn)結(jié)果與生長養(yǎng)殖活動(dòng)相符。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前期處理

將櫛孔扇貝保持潮濕狀態(tài)下運(yùn)回養(yǎng)殖車間進(jìn)行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)水溫12～14 ℃;暫養(yǎng)期間每天07 ∶30和17 ∶30定量投喂三角褐指藻，連續(xù)充氣，流水養(yǎng)殖，暫養(yǎng)7 d后挑選活力較強(qiáng)的健康扇貝進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置無（0）、10%、20%、30%、50%河水添加量共計(jì)5個(gè)試驗(yàn)組，海水鹽度為3.3%。添加后的試驗(yàn)組組鹽度分別為3.30%、2.97%、2.64%、2.31%、1.65%。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放入60只櫛孔扇貝，養(yǎng)殖水溫12～14 ℃。試驗(yàn)期間每天07 ∶30和17 ∶30定量投喂三角褐指藻，連續(xù)充氣，每天換水（換水量為100%）。

暫養(yǎng)期間，隨機(jī)選取9只櫛孔扇貝測定耗氧率和排氨率，取3只櫛孔扇貝測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，每個(gè)指標(biāo)設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)開始后，在試驗(yàn)1、6、24、48、120、192、264、336 h時(shí)，每個(gè)平行分別隨機(jī)選取3只櫛孔扇貝測其耗氧率和排氨率，取3只櫛孔扇貝測其SOD活性，每個(gè)指標(biāo)設(shè)3個(gè)平行;在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取剩余櫛孔扇貝測定其體內(nèi)重金屬含量。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 營養(yǎng)鹽及水文參數(shù)

銨態(tài)氮（NH+4-N）濃度測定采用次溴酸鈉氧化法[21-23]，銨態(tài)氮（NO-3-N）濃度測定采用重氮-偶氮法[21-23]，硝態(tài)氮（NO-2-N）濃度測定采用鋅-鎘還原法，pH值采用pH計(jì)測定，溶解氧含量測定采用Winker碘量法。

1.3.2 存活率

試驗(yàn)過程中記錄各試驗(yàn)組櫛孔扇貝死亡數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算存活率。

1.3.3 耗氧率和排氨率

采用靜水密封法，將完好的自封袋（確保嚴(yán)格密封）放入水槽中，灌入一定體積的海水，放入櫛孔扇貝并排出空氣，持續(xù)2 h。溶解氧（DO）含量的測定采用Winker碘量法，NH+4-N濃度測定采用次溴酸鈉氧化法[21-23]。

根據(jù)試驗(yàn)前后溶解氧含量的變化計(jì)算單位濕質(zhì)量耗氧率：

RO=[C0（DO）-Ct（DO）]V/mt;

式中：C0（DO）和Ct（DO）分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)試驗(yàn)水中DO含量，mg/L;V為試驗(yàn)用水的體積，L;m為試驗(yàn)貝軟組織濕質(zhì)量，g;t為試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間，h。

根據(jù)試驗(yàn)前后氨氮濃度的變化計(jì)算單位濕質(zhì)量排氨率：

RN=[Ct（N）-C0（N）]V/mt;

式中：C0（N）和Ct（N）分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)試驗(yàn)水中氨氮濃度，μmol/L;V為試驗(yàn)用水的體積，L;m為試驗(yàn)貝軟組織濕質(zhì)量，g;t為試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間，h。

1.3.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性

冰浴條件下取櫛孔扇貝閉殼肌放入凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆?。SOD活性的測定采用南京建成生物公司的試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行。

1.3.5 重金屬含量

采用原子吸收分光光度法[24-25]，測定不同試驗(yàn)組扇貝體內(nèi)Cr、Pb、Cd、As、Hg等重金屬含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析比較，采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncans多重比較分析，P<0.05表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 河水、海水水質(zhì)的基本情況

由表1可知試驗(yàn)用海水和河水水質(zhì)的基本情況，海水符合國家規(guī)定的二類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，河水符合國家規(guī)定的三類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 不同河水添加量對櫛孔扇貝存活率的影響

由圖1可知，0、10%、20%河水添加試驗(yàn)組存活率較高，均在95%以上，顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05）;其次是30%河水添加組，存活率為91%;50%河水添加組存活率顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05），并隨著時(shí)間的延長逐漸下降，6 h為94%，24 h 為89%，48 h為67%，120 h時(shí)全部死亡。

2.3 不同河水添加量對櫛孔扇貝耗氧率和排氨率的影響

由圖2可知，試驗(yàn)過程中櫛孔扇貝的耗氧率在2.21～39.09 μg/（g·h）之間，0、10%、20%河水添加試驗(yàn)組的耗氧率在1、48、120、192、264、336 h時(shí)均顯著高于30%、50%河水添加試驗(yàn)組（P<0.05）;在6 h時(shí)，各試驗(yàn)組耗氧率均出現(xiàn)不同程度降低，無河水添加試驗(yàn)組降低的原因可能與流水養(yǎng)殖突變?yōu)殪o水養(yǎng)殖有關(guān);在24、48 h時(shí)，各試驗(yàn)組耗氧率呈現(xiàn)上升趨勢，處于不穩(wěn)定階段，經(jīng)分析，可能是因?yàn)辂}度改變導(dǎo)致櫛孔扇貝出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)行自身調(diào)節(jié);120 h后逐漸趨于穩(wěn)定;在264、336 h 時(shí)，10%河水添加試驗(yàn)組耗氧率最高，顯著高于0、20%河水添加試驗(yàn)組（P<0.05），30%河水添加試驗(yàn)組最低，顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05）;在1～48 h，50%河水添加試驗(yàn)組耗氧率持續(xù)最低，顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05）。

由圖3可知，不同河水添加量對櫛孔扇貝排氨率的影響與耗氧率呈現(xiàn)類似的趨勢，櫛孔扇貝的排氨率在0.05～0.77 μg/（g·h）之間。在試驗(yàn) 1～48 h 之間，無河水添加試驗(yàn)組排氨率與暫養(yǎng)時(shí)差異不顯著（P>0.05），其他試驗(yàn)組均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;120 h后趨于穩(wěn)定，在264、336 h時(shí)，10%河水添加試驗(yàn)組排氨率最高，略高于0、20%河水添加試驗(yàn)組（P>0.05），30%河水添加試驗(yàn)組最低，顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05）;在1～48 h，50%河水添加試驗(yàn)組排氨率持續(xù)最低，顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05）。

2.4 不同河水添加量對櫛孔扇貝超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖4可知不同河水添加量對櫛孔扇貝閉殼肌SOD活性的影響，櫛孔扇貝閉殼肌SOD活性在23.73～45.42 U/mg之間，整個(gè)試驗(yàn)過程中，無河水添加試驗(yàn)組SOD活性與暫養(yǎng)時(shí)無顯著差異（P>0.05）。在試驗(yàn)1 h時(shí)，0、10%、20%、30%河水添加試驗(yàn)組SOD活性與暫養(yǎng)時(shí)處于同一水平，無顯著差異（P>0.05），50%河水添加試驗(yàn)組SOD活性最低，顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05）;在試驗(yàn)1～48 h 之間， 10%、 20%、 30%、50%河水添加試驗(yàn)組出現(xiàn)先下降后升高的趨勢;120 h后趨于穩(wěn)定，無河水添加試驗(yàn)組SOD活性顯著高于10%、20%、30%河水添加試驗(yàn)組（P<0.05）。

2.5 不同河水添加量對櫛孔扇貝體內(nèi)重金屬含量的影響

由表2可知，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各不同處理組櫛孔扇貝體內(nèi)Pb、Cr、Cd、Hg、As的含量（以濕質(zhì)量計(jì)），櫛孔扇貝體內(nèi)Pb含量范圍為0.086～0.124 mg/kg，Cr含量范圍為0.059～0.086 mg/kg，Cd含量范圍為 0.085～0.363 mg/kg，Hg含量范圍為0.034～0.044 mg/kg，As含量范圍為0.276～0.391 mg/kg，可見櫛孔扇貝體內(nèi)5種重金屬含量均未超標(biāo)。50%河水添加組于120 h全部死亡，不參與比較。無河水添加組Pb、Cr、Hg、As均顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.05），可見河水的添加可能導(dǎo)致櫛孔扇貝體內(nèi)重金屬含量的增加。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)50%河水添加試驗(yàn)組于120 h全部死亡，其他試驗(yàn)組存活率均在90%以上。吳靜研究發(fā)現(xiàn)，鹽度在2.6%～3.2%時(shí)，華貴櫛孔扇貝的存活率較高，均在85%以上，鹽度1.8%時(shí)，120 h全部死亡[14]，與本研究結(jié)果基本一致。說明極端鹽度脅迫導(dǎo)致海水滲透壓的改變超過了櫛孔扇貝自身的調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致櫛孔扇貝代謝紊亂，甚至死亡[24]。

呼吸和排泄是貝類新陳代謝的基本生理活動(dòng)，也是貝類能量學(xué)、貝類養(yǎng)殖容量研究以及貝類對海洋生態(tài)系統(tǒng)影響的重要評價(jià)內(nèi)容[18]，不僅可以反映貝類的生理活動(dòng)，還可以反映環(huán)境條件對貝類生理活動(dòng)的影響。在一定鹽度范圍內(nèi)，華貴櫛孔扇貝、泥螺、泥蚶的耗氧率和排氨率都隨著鹽度的升高而升高，分別在鹽度3.2%、2.8%、2.8%時(shí)最高，隨后逐漸降低[14，25-26]。本研究的耗氧率和排氨率也呈現(xiàn)先下降后上升再趨于穩(wěn)定的趨勢，穩(wěn)定后10%河水添加組最高，即鹽度2.97%時(shí)達(dá)到最大值，與上述研究結(jié)果一致。有學(xué)者認(rèn)為，出現(xiàn)上述情況的原因是貝類在超出適應(yīng)的海水鹽度范圍后，為了適應(yīng)周圍環(huán)境滲透壓的變化，通過降低耗氧率和排氨率等來維持正常的生理活動(dòng)[25];在試驗(yàn)1～48 h耗氧率和排氨率均出現(xiàn)較大的波動(dòng)，尤其在24、48 h時(shí)，10%、20%、30%河水添加組耗氧率出現(xiàn)顯著升高，可能是由于櫛孔扇貝為減輕鹽度變化的影響，需要消耗大量的能量調(diào)節(jié)自身滲透壓[13]，進(jìn)而保持正常的生命體征。

超氧化物歧化酶（SOD）是一種抗氧化酶，可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力和吞噬細(xì)胞的防御能力[27]，保護(hù)機(jī)體免受活性氧自由基的損傷[28-29]，可以反映貝類機(jī)體的健康狀態(tài)[30]。本研究顯示，在試驗(yàn)1 h時(shí)，其他試驗(yàn)組SOD活性與暫養(yǎng)時(shí)處于同一水平，顯著高于50%試驗(yàn)組（P<0.05）。50%試驗(yàn)組SOD活性持續(xù)最低，表明極端的鹽度變化超出了櫛孔扇貝的自我調(diào)節(jié)能力。而10%、20%和30%河水添加組SOD活性在6～336 h之間先下降后上升并趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定后顯著低于無河水添加組（P<0.05）。劉美劍報(bào)道了鹽度變化導(dǎo)致扇貝血清中SOD活性顯著下降后逐漸恢復(fù)[8]，與本研究這一趨勢類似。6～48 h之間是SOD活性上升的階段，說明機(jī)體在通過自身調(diào)節(jié)提高SOD活性以清除由于鹽度脅迫積累的大量活性氧自由基，來提高自身免疫能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，添加河水后，櫛孔扇貝體內(nèi)Pb、Cr、Hg、As含量顯著增加，海洋動(dòng)物對重金屬具有較強(qiáng)的富集性，人類經(jīng)食物鏈可將富集在其體內(nèi)的重金屬進(jìn)一步積累，危害身體健康[31]。工業(yè)廢水、生活污水等經(jīng)河流進(jìn)入海洋，造成海洋環(huán)境污染，尤其是重金屬污染，對于櫛孔扇貝、貽貝、牡蠣等濾食性貝類來說，極易造成體內(nèi)重金屬含量超標(biāo)，人類食后在體內(nèi)聚集又很難去除，嚴(yán)重導(dǎo)致結(jié)蹄組織受損，肌肉萎縮，甚至癌變死亡[32]。

綜上所述，夏季降雨頻發(fā)、河水大量流入海洋，不僅會(huì)對近岸養(yǎng)殖的海產(chǎn)品造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)可能威脅人類健康，因此工業(yè)廢水和生活污水要處理達(dá)標(biāo)后排放。本研究對河水添加后櫛孔扇貝生理、免疫、重金屬等指標(biāo)的影響進(jìn)行初步探究，并不能全方位了解其本質(zhì)影響，還需進(jìn)一步探究。

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