白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒主要成分量值傳遞規(guī)律及對脾虛模型大鼠腸道調(diào)節(jié)作用的研究*

俞忠明 鄭純威 施佳君 富丹婷 壽 旦

浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

白術(shù)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為菊科植物白術(shù)（Atractylodes Macrocephala Koidz.）的干燥根莖[1]。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗等功效，主治脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗等癥，為“健脾補氣第一要藥”。本實驗在白術(shù)藥材-飲片-顆粒劑中主要成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ成分研究的基礎(chǔ)上，對脾虛大鼠模型胃泌素（GAS）、血管活性腸肽（VIP）指標檢測，初步探討白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒中主要成分的量值傳遞規(guī)律及對脾虛大鼠模型腸道調(diào)節(jié)作用，以期為白術(shù)的進一步開發(fā)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器：Power Wave XS型全波長酶標儀（美國BioTek公司）；J-15R冷凍型高效臺式離心機[貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司]；U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司）；YJ-40L/h型超純水機(杭州余杭亞潔水處理設(shè)備有限公司)；FW177型中草藥粉碎機；AE-50電子天平(瑞士梅特勒)；HH-8水浴鍋（常州市江南實驗儀器廠）；KQ400超聲提取器(江蘇昆山)；GS-6R離心機（Beckman公司）。

1.2 藥材與試劑：大黃（批號：200508），白術(shù)藥材10批（ 批 號 分 別 為 20180269、20180270、20180272、20180274、20180275、20180277、20180278、20180279、20180280、20180281），白術(shù)飲片 10批（批號分別為20180289、20180294、20180296、20180299、201802101、201802103、 201802104、 201802105、 201802106、201802107），麩炒白術(shù)配方顆粒選擇同一批號不同時間段生產(chǎn)的10個品種（批號為K2004022，每3g顆粒劑相當于白術(shù)飲片10g），均購自浙江景岳堂藥業(yè)有限公司；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品（批號分別為111975-201501、111976-201501、111978-201501），均購自中國食品藥品檢定研究院；GAS試劑盒[酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，批號：JL21322]、VIP試劑盒（ELISA法，批號：JL12942），均購自上海江萊生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物：SPF級雄性SD大鼠30只，體重200±20g，購自杭州醫(yī)學院，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 白術(shù)藥材-飲片-顆粒劑中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量值傳遞規(guī)律研究：分述如下。

2.1.1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測定：①色譜條件[2]：ThermosyncronisC18色 譜 柱（4.6mm×250.0mm，5μm），以乙腈（A）和水（B）為流動相，梯度洗脫條件：0～16min、40%～24%B，16～18min、24%～0B；18～30min、0%B，流速：1.0ml/min，柱溫：25℃，進樣體積10μl。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ檢測波長276nm、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測波長220nm。理論塔板數(shù)按白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ計算高于5000。②對照品溶液的制備：取三種白術(shù)內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1ml含白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為0.114mg、0.078mg、0.321mg的溶液，即得。③供試品溶液制備：取白術(shù)藥材、飲片、配方顆粒樣品粉末（過三號篩）約1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，稱重，超聲提取30min，放至室溫，稱重，加甲醇補足重量，搖勻，取上清液濾過，取續(xù)濾液25ml蒸發(fā)皿75℃水浴濃縮至約2ml，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中并定容，即得。④樣品含量測定：按照上述色譜條件測定不同批次白術(shù)藥材、飲片和配方顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量。

2.1.2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ量值傳遞規(guī)律分析：將白術(shù)配方顆粒的含量轉(zhuǎn)換成相當于每1g飲片含量白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量（mg/g），采用SPSS 20.0作白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的比較分析，以探討其量值傳遞規(guī)律。結(jié)果顯示，白術(shù)藥材中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量最高，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ次之，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ最少；白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量反而最低，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ最高，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ次之；同樣在白術(shù)配方顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的含量也是最低的，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ最高，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ其次，詳細結(jié)果見圖1。

圖1 白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量比較圖

2.2 白術(shù)藥材、飲片及配方顆粒對脾虛模型大鼠相關(guān)指標的影響：分述如下。

2.2.1 給藥樣品的制備：①白術(shù)藥材提取液制備：取白術(shù)藥材適量，加入8倍量水，浸泡30min，煎煮1.5h，過濾，藥渣加6倍量水，煎煮1h，過濾，合并2次濾液，濃縮成每1ml相當于含1g白術(shù)生藥的溶液，即得。②白術(shù)飲片提取液制備：取白術(shù)飲片適量，加入8倍量水，浸泡30min，煎煮1.5h，過濾，藥渣加6倍量水，煎煮1h，過濾，合并2次濾液，濃縮成每1ml相當于含1g白術(shù)飲片的溶液，即得。③白術(shù)配方顆粒藥液制備：取白術(shù)配方顆粒適量，加水適量，加熱溶解，制成每1ml相當于含1g生藥的溶液，即得。④大黃水煎液制備：取大黃飲片適量，第1次加8倍量水，浸泡30min，提取1h，過濾；藥渣加6倍量水，提取0.5h，過濾，合并2次提取液，濃縮，制成每1ml相當于含1g大黃的濃縮液，即得。

2.2.2 分組、造模和給藥：將30只雄性SD大鼠隨機分成5組，分別為空白組、模型組、白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組，每組6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，空白組大鼠按10ml/kg灌胃給予生理鹽水，其余各組均按10ml/kg灌胃給予大黃水煎液，以制備大鼠脾虛模型，每天1次，連續(xù)15天。自第16天起，空白組和模型組均按10ml/kg給予生理鹽水，其余各組均按10ml/kg分別給予白術(shù)藥材提取液、白術(shù)飲片提取液、白術(shù)配方顆粒溶液，每天1次，連續(xù)10天。

2.2.3 大體觀察：觀察各組大鼠的皮毛、大鼠排泄物情況以及活動狀況，并分別于造模前、造模后（給藥前）以及末次給藥后稱定體重，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果顯示，造模前，各組大鼠體重比較差異不明顯，結(jié)果無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。造模后，除空白組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)食量減小、體型消瘦、大便溏稀、皮毛枯槁、精神萎靡、蜷縮等不同程度的由于脾虛泄瀉導致的胃腸道癥狀；造模后，空白組大鼠體重比同組造模前顯著增加，與空白組比較，其余各組大鼠的體重均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與模型組比較，白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組大鼠體重顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），白術(shù)配方顆粒組大鼠體重變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。末次給藥后，各組大鼠上述脾虛癥狀均有不同程度改善，空白組、白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組大鼠的體重均比同組造模前顯著增加，與空白組比較，模型組大鼠的體重顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組大鼠體重均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒對脾虛模型大鼠體重的影響（±s，g，n=6）

表1 白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒對脾虛模型大鼠體重的影響（±s，g，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組白術(shù)藥材組白術(shù)飲片組白術(shù)配方顆粒組末次給藥后296.50±10.64 241.00±4.78**285.83±8.04*##281.00±7.32**##266.17±4.40**##造模前243.33±10.67 240.17±4.79 244.83±9.06 241.33±9.87 232.83±4.75造模后276.17±10.59 232.33±4.76**254.17±8.13**##248.33±9.44**#238.00±5.22**

2.2.4 血清GAS、VIP含量測定：末次給藥后，將所有大鼠禁食、不禁水12h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置1h后，以4000r/min離心10min，分離血清，采用ELISA法，以全波長多功能酶標儀于450nm波長處檢測血清GAS和VIP含量。

結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清GAS含量顯著降低，VIP含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組大鼠血清GAS含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組大鼠血清VIP含量升高不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組大鼠血清GAS含量均顯著提高，白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組大鼠血清VIP含量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳細結(jié)果見表2。

表2 白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒對脾虛模型大鼠GAS、VIP含量的影響（±s，pg/L，n=6）

表2 白術(shù)藥材-飲片-配方顆粒對脾虛模型大鼠GAS、VIP含量的影響（±s，pg/L，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組白術(shù)藥材組白術(shù)飲片組白術(shù)配方顆粒組VIP 184.50±6.50 221.67±31.65*187.33±8.71#189.33±9.65#190.00±10.51#GAS 245.50±20.32 129.00±7.46*153.17±10.36*#162.67±13.60*#161.50±9.75*#

3 討論

白術(shù)的主要功效為健脾益氣，現(xiàn)代藥理研究表明其具有調(diào)節(jié)胃腸道作用，且作用強度與劑量有關(guān)，并且炮制、提取方法等對白術(shù)的胃腸道作用影響顯著。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是其主要活性成分和特征性成分，通常作為衡量白術(shù)藥材質(zhì)量的參考指標[3]。有研究表明，炮制過程中主要的內(nèi)酯類成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[4]和蒼術(shù)酮之間發(fā)生復雜的相互轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在藥材中的含量最高，在飲片、配方顆粒中3種成分的含量都有一定程度的降低，表明白術(shù)內(nèi)酯類成分不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化，炮制、加熱、提取等方法的運用可以促進其轉(zhuǎn)化成其他成分。

中醫(yī)學認為，脾主運化，稱其為“氣血生化之源”，其功能與小腸吸收、胃腸激素分泌等密切相關(guān)。在中醫(yī)理論中，脾虛泛指脾氣虛損造成的一系列身體臟器失調(diào)的多種生理現(xiàn)象。脾虛包含運化功能失常導致營養(yǎng)吸收功能出現(xiàn)障礙，水液失于布散導致體濕痰多等。脾失健運可導致腹脹、泄瀉等腸道功能紊亂癥狀。大黃瀉下致大鼠脾虛模型是公認的脾虛模型經(jīng)典方法之一，故本研究選擇該方法建立大鼠脾虛模型[5-7]。脾虛泄瀉可導致大鼠腸道功能紊亂，體重下降，故大鼠體重的高低也間接反映了其腸道功能的正常與否。本實驗中，造模后大鼠體重明顯下降，而給藥后白術(shù)藥材、飲片和配方顆粒組大鼠體重均有明顯提升，間接表明了白術(shù)藥材、飲片、配方顆粒具有調(diào)節(jié)大鼠胃腸道功能、改善脾虛癥狀的作用，印證了白術(shù)的健脾益氣之功效。

GAS是一種很重要的胃腸道激素，主要是由胃竇G細胞分泌，具有調(diào)節(jié)吸收、轉(zhuǎn)運及代謝等生理活性，是衡量胃腸道生理功能的主要指標，其含量的降低提示消化道功能處于低下或紊亂狀態(tài)[8]。VIP是腸道主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，其可抑制胃酸的分泌，是胃腸道疾病研究的重要指標[9]。本研究中，造模后模型組大鼠血清GAS含量較空白組有顯著降低，而VIP含量顯著升高。用藥后，白術(shù)藥材、飲片、配方顆粒組大鼠血清GAS含量有一定程度的提升，而其VIP含量有明顯降低，這表明白術(shù)藥材、飲片、配方顆粒對脾虛模型大鼠腸道的改善作用與調(diào)節(jié)腸道GAS、VIP含量有一定的關(guān)系。本實驗研究結(jié)果并沒有揭示白術(shù)藥材組、白術(shù)飲片組、白術(shù)配方顆粒組對脾虛模型大鼠的作用與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有明確的量效關(guān)系，有待進一步實驗研究。