生物樣品中唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的測定

摘要：神經(jīng)節(jié)苷脂屬于神經(jīng)鞘脂類，結(jié)構(gòu)中含有一種或多種唾液酸，是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成成分。神經(jīng)節(jié)苷脂和唾液酸都是具有生物活性的化合物。由于它們具有生物相關(guān)性，因此與每種基質(zhì)相對應(yīng)的分析方法也都得到了一定的發(fā)展。本文就生物樣品中適用于唾液酸和神經(jīng)節(jié)苷脂的主要分析方法做一下總結(jié)概述。

關(guān)鍵詞：生物樣品 ;唾液酸;神經(jīng)節(jié)苷脂

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類含有唾液酸的酸性鞘糖脂 ，是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成成分，結(jié)構(gòu)中含有一種或多種成分的唾液酸，更確切的說，神經(jīng)節(jié)苷脂是由鞘氨基醇與脂肪酸相結(jié)合，然后通過酰胺鍵連接到包含一種或多種唾液酸的低聚糖鏈上。在物理?xiàng)l件下，唾液酸分子中含有一個(gè)負(fù)電荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年來，隨著對細(xì)胞膜表面糖類生理功能研究的日益重視，神經(jīng)節(jié)苷脂的研究也日趨受到科學(xué)界的關(guān)注，特別是隨著神經(jīng)生物化學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)的發(fā)展，對神經(jīng)節(jié)苷脂的代謝及其生物學(xué)作用研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)的重要課題。神經(jīng)節(jié)苷脂在國內(nèi)大多數(shù)依賴進(jìn)口，雖然國內(nèi)外已報(bào)道了多種分離純化的方法，但大多都有操作步驟繁瑣、溶劑用量大等不足之處。目前國內(nèi)外的研究主要集中于其與生物膜其他有效成分之間的相互作用，而對神經(jīng)節(jié)苷脂的分離方法的最佳選擇未給予詳細(xì)的報(bào)道。因此，本文就多種分離純化方法做一下比較總結(jié)，對其分離過程起到一定的幫助。

一、 唾液酸的測定

1.分光光度法

應(yīng)用最廣泛的分光光度法是由Svennerholm發(fā)明的，后人對這種方法又做了一定的修正，即用陰離子交換法來提高純度。采用這種方法時(shí)在蔗糖與間苯二酚之間發(fā)生反應(yīng)。由于唾液酸是糖脂類神經(jīng)節(jié)苷酯物質(zhì)所含有的特征基團(tuán)，因此當(dāng)與間苯二酚反應(yīng)生成紫色復(fù)合物可用于神經(jīng)節(jié)苷脂的含量測定。本法主要用于人體組織和生物體液的檢測，但一些研究者已經(jīng)將其用于乳制品檢測當(dāng)中，如牛奶制品和嬰兒奶粉的檢測。

2.液相色譜法

液相色譜法也是測定唾液酸較常用的方法，當(dāng)樣品沒有被衍生化的時(shí)候，最常用的方法就是紫外檢測離子對的方法。這種方法最初是由Spyridiaki與Siskos聯(lián)合研究出來的]，他們通過實(shí)驗(yàn)?zāi)M提高了以下物質(zhì)檢測時(shí)的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙?；?9-O-乙酰神經(jīng)氨酸等。在分析中使用了多種親脂的陽性離子對，如四辛基溴化銨（TOA-Br）三異丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用時(shí)一般選用TIP，因?yàn)樗膹?qiáng)度和分離度更好，但在操作中必須要注意PH的控制，（最佳值為3.5），這是決定因素。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這種方法應(yīng)用到血清、尿液、唾液當(dāng)中時(shí)，只能區(qū)分兩種形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en），在純化步驟中必須除去蛋白質(zhì)。由于其限制條件較多，因此在分析結(jié)構(gòu)較多的唾液酸混合物時(shí)不推薦使用本方法。

3.氣相色譜法

氣象色譜法（GC）與質(zhì)譜法聯(lián)用起初是用來鑒定苷脂鍵及衍生反應(yīng)后的氧代神經(jīng)氨酸，Zanetta等人在此基礎(chǔ)上研究了一種非常有效的方法，用來測定唾液酸標(biāo)準(zhǔn)液及生物體液如馬血清及牛、羊、馬的下顎下腺粘蛋白等]。這種方法是在無水甲醇和使用七氟酸酐形成的揮發(fā)性衍生物存在的前提下，通過重氮甲烷酐的甲基酯化進(jìn)行氣相色譜/質(zhì)譜電子轟擊的。這種方法能夠區(qū)分大部分的唾液酸，包括O -?；腘eu5Ac，Neu5Gc和8-O-鄰甲基和8 - O -硫酸衍生物以及1，7 -唾液酸內(nèi)酯。在后面的研究中，這個(gè)研究小組對本方法做了小的修改，從而對單糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素當(dāng)中可以更好定位。樣品仍可以用相同的反應(yīng)容器，并按照分析唾液酸的方法用GC /質(zhì)譜進(jìn)行分析。相對于上面的方法，本法的測定范圍更加全面，其應(yīng)用前景也更加廣泛。

二、神經(jīng)節(jié)苷脂的測定

總神經(jīng)節(jié)苷脂量可以通過分離純化唾液酸內(nèi)容物來定量，量化結(jié)果可以用脂鍵聯(lián)合唾液酸的方式表達(dá)。

1.質(zhì)譜分析測定

質(zhì)譜（MS）能夠利用薄層色譜與高效液相色譜板來鑒別及定量神經(jīng)節(jié)苷脂，雖然這種方法的靈敏性較TLC/HPTLC免疫染色法低，但這兩種方法都可以作為薄層掃描法測定神經(jīng)節(jié)苷脂的補(bǔ)充方法。薄層色譜法與快原子轟擊（FAB）及質(zhì)譜連用的優(yōu)點(diǎn)歸因于FAB-MS與氣相、液相及超臨界流體色譜儀是從生物反應(yīng)表面得出結(jié)果的最有效方法。TLC-FAB-MS連用效率高且省時(shí)，但條件是仍然需要大分子的解吸附來增加靈敏度，并盡量減少基質(zhì)中離子源的污染。因此，這種方法對樣本的要求很高，在實(shí)際的應(yīng)用中也會(huì)受到一定的限制。

2.液相色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)用

近幾年，一項(xiàng)液相色譜法與質(zhì)譜法連用的技術(shù)逐步發(fā)展起來，實(shí)驗(yàn)證明，這種方法能夠用于牛奶及嬰兒配方中的神經(jīng)節(jié)苷脂中GD3 和 GM3的測定。其GD3與GM3的重現(xiàn)性分別小于5%和14%，其覆蓋范圍在83%到87%之間。由于本法的重現(xiàn)性比較低，所以不建議直接應(yīng)用，在進(jìn)一步研究及改進(jìn)之后，相信本方法會(huì)成為一種可靠的分析方法應(yīng)用到實(shí)際操作中去。

三、結(jié)論

分光光度法不僅可以將生物試樣中的唾液酸進(jìn)行定量分析，還可以將總神經(jīng)節(jié)苷脂量進(jìn)行分析測定，因此現(xiàn)在仍然是主要的分析方法。其應(yīng)用方式主要為脂類與唾液酸的聯(lián)合應(yīng)用。而色譜技術(shù)能夠?qū)煞N主要結(jié)構(gòu)的唾液酸進(jìn)行區(qū)分，這種方法不僅可以測定樣品的原始數(shù)據(jù)還可以檢測在臨床環(huán)境中唾液酸代謝情況的變化（如癌癥的早期診斷）。

神經(jīng)節(jié)苷脂在生物試樣中的檢測都需要一系列冗長的準(zhǔn)備工作，如提取、分離以及純化工作，但這又是最關(guān)鍵性的操作步驟，因?yàn)檫@些步驟可以從根本上反應(yīng)出實(shí)際的損耗，要將所有干擾源消除非常困難，只能盡量減少。所以在分析過程中，一定要認(rèn)真將此前期工作認(rèn)真準(zhǔn)備。

神經(jīng)節(jié)苷脂測定的未來趨勢是利用質(zhì)譜分析來闡釋所有結(jié)構(gòu)的神經(jīng)節(jié)苷脂、糖鏈、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且調(diào)節(jié)他們的生物活性。本文對多種分析方法做了分析與比較，為神經(jīng)節(jié)苷脂的開發(fā)利用提供了理論和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，這就是分析所有鑒別方法的意義所在。

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作者簡介：

高靜（1985.09--），女，漢族，山東淄博人，工程師，碩士研究生，主要從事藥物化學(xué)、制藥工程等研究