人溶瘤腺病毒的研究進(jìn)展

申祖杰 王艷杰 康燕燕 林楠 高劍文

摘 要 溶瘤腺病毒是一種經(jīng)過(guò)人工改造的，可以特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的一類腺病毒。常用的腺病毒為致病力弱的人血清2型或5型腺病毒。該病毒對(duì)正常機(jī)體的細(xì)胞無(wú)明顯不良反應(yīng)，但是可以特異性地在腫瘤細(xì)胞中大量增殖、裂解腫瘤細(xì)胞和破壞腫瘤微環(huán)境。在溶瘤腺病毒的作用下被感染的腫瘤細(xì)胞釋放出大量的腫瘤特異性抗原，進(jìn)而激發(fā)全身性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，最終達(dá)到治療腫瘤的目的。溶瘤腺病毒治療腫瘤不良反應(yīng)小、精度高、抗干擾能力強(qiáng)，具有廣闊的運(yùn)用前景。

關(guān)鍵詞 溶瘤腺病毒 腫瘤 免疫療法 聯(lián)合用藥

中圖分類號(hào)：R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）21-0076-05

Research progress of human oncolytic adenovirus

SHEN Zujie1， WANG Yanjie2， KANG Yanyan2， LIN Nan2， GAO Jianwen2

（1. Shanghai Sunway Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China； 2. Shanghai Medical Staff University， Shanghai 200135， China）

ABSTRACT Oncolytic adenovirus is a type of human adenovirus that is artificially modified and can specifically kill tumor cells. Commonly used adenovirus is human adenovirus serotype 2 or serotype 5， both are weakly pathogenic adenoviruses. This virus has no obvious adverse reactions to normal body cells， however， it can specifically proliferate in tumor cells in large quantities and lyse tumor cells and destroy the tumor microenvironment. Under the action of oncolytic adenovirus， the infected tumor cells release a large number of tumor-specific antigens， which ultimately stimulate a systemic anti-tumor immune response， and finally achieve the purpose of treating tumors. Oncolytic adenovirus for the treatment of tumors has small adverse reactions， high precision and strong anti-interference abilities and may have broad application prospects.

KEy wORDS oncolytic adenovirus； tumor； immunization therapy； drug combination

惡性腫瘤是目前威脅人類生命健康的重大疾病之一，是繼心血管疾病的世界第二大死因，全球有近1/6的死亡是由癌癥造成的，且近十幾年來(lái)惡行腫瘤的發(fā)病率每年呈現(xiàn)約3.9%的上升態(tài)勢(shì)，死亡率每年呈2.5%的上升態(tài)勢(shì)，防控形勢(shì)極其嚴(yán)峻[1]。目前針對(duì)腫瘤的治療主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、中醫(yī)中藥治療和生物免疫療法等5種，其中生物免疫療法逐漸展現(xiàn)出其治療優(yōu)勢(shì)。溶瘤腺病毒療法屬于生物免疫療法范疇，是通過(guò)分子生物學(xué)的方法，人為改造腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)，使該病毒特異性地感染腫瘤細(xì)胞，而不對(duì)正常細(xì)胞造成威脅的一種新型治療方法[2]。至今世界上已有2種腺病毒類腫瘤藥物上市，分別為復(fù)制缺陷型人p53注射液（商品名：今又生），和人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞），其中安柯瑞是世界上首個(gè)上市的溶瘤腺病毒藥物[3]。目前世界范圍內(nèi)有20多種腺病毒相關(guān)腫瘤藥物處于臨床試驗(yàn)階段，且治療及臨床數(shù)據(jù)結(jié)果表明，溶瘤腺病毒治療效果明顯，不良反應(yīng)小，具有極其優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用前景。本文將著重從腺病毒的生物學(xué)特性、作用機(jī)制、溶瘤腺病毒類型、新藥研發(fā)進(jìn)展、治療策略以及未來(lái)的發(fā)展方向及問(wèn)題等方面加以闡述。

1 腺病毒分類及分子特性

腺病毒是首次從人腺體細(xì)胞發(fā)現(xiàn)并分離到的無(wú)包膜、雙鏈DNA、大小約為70～90 nm的一類病毒。人腺病毒根據(jù)其病毒顆粒表面表位的不同分為6個(gè)亞屬，57個(gè)血清型。不同血清型的腺病毒，致病性及感染部位具有很大的區(qū)別，其中基因治療和溶瘤病毒常用的是C亞屬的2型和5型人腺病毒。人腺病毒2型和5型遺傳背景清楚、重組方法成熟，是研究較為詳細(xì)的人類腺病毒。腺病毒基因組為線性雙鏈DNA，其兩端各有1個(gè)100～600 bp的反向終端重復(fù)序列（inverted terminal repeat， ITR），其內(nèi)側(cè)包含腺病毒早期復(fù)制相關(guān)的E1-E4基因，和晚期表達(dá)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的L1-L5基因[4]。其中E1區(qū)和E3區(qū)與病毒的復(fù)制特性以及免疫逃避功能相關(guān)，是常被用來(lái)敲除和改造的區(qū)域。E1區(qū)分為E1A和E1B，E1A主要由289R和243R構(gòu)成，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝功能而使細(xì)胞更易感，E1B 55K基因產(chǎn)物可以與細(xì)胞中的p53蛋白相互作用，使其喪失功能，進(jìn)而阻止p53基因表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞分裂停止或細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，此外E1B 55K基因產(chǎn)物還與病毒復(fù)制、病毒晚期mRNA的轉(zhuǎn)錄以及病毒RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)。E3區(qū)域基因表達(dá)產(chǎn)物的主要功能是破壞免疫防御機(jī)制，而與病毒基因組的復(fù)制無(wú)關(guān)，其中g(shù)p19K蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex， MHC）I類分子的重鏈結(jié)合而阻止其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面、延緩MHC I的表達(dá)，進(jìn)而破壞被感染細(xì)胞的免疫防御機(jī)制，而使病毒大量復(fù)制，最終裂解細(xì)胞[5]。

2 目前常見溶瘤腺病毒的類型

2.1 自然篩選型溶瘤腺病毒

有些病毒具有天然的腫瘤靶向作用，如腺病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒等，人們通過(guò)特異性篩選這些病毒作為治療工具來(lái)治療腫瘤[2]。1956年美國(guó)國(guó)立癌癥研究所開展了對(duì)30名宮頸癌患者采用不同血清型的野生腺病毒的腫瘤治療臨床研究，結(jié)果顯示，半數(shù)以上患者的腫瘤縮小，但該實(shí)驗(yàn)只顯示了局部治療效果，出于對(duì)野生篩選型腺病毒的安全性及未知隱患的考慮，該方法當(dāng)時(shí)未被廣泛推廣。直到1996年有研究表明，帶有E1B 55 K基因突變的腺病毒可選擇性地在p53缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，從而引起了人們對(duì)腺病毒的再次廣泛關(guān)注[6]。

2.2 非轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向型溶瘤腺病毒

該方法主要是通過(guò)分子生物學(xué)的方法，特異性刪除腺病毒的毒性基因如55 kD以及免疫逃避相關(guān)基因如gp19K，從而降低腺病毒的毒性，或?qū)⑵涠拘曰蛱鎿Q為免疫監(jiān)查位點(diǎn)基因如程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1， PD1）、細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1， PDL1）或其他相關(guān)基因如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF）、白介素-2（interleukin-2， IL-2）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）等[7]，或者將腺病毒啟動(dòng)子替換為腫瘤特異性啟動(dòng)子如TERT等。其中GM-CSF基因較為常用，其表達(dá)產(chǎn)物的重要作用是刺激粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的成熟，并繼發(fā)其多種功能。1996年Onyx公司的溶瘤腺病毒dl1520在《科學(xué)》雜志發(fā)表，同年上海三維生物技術(shù)有限公司基于Onyx-015抗癌理論研發(fā)出了目前國(guó)內(nèi)唯一上市的溶瘤病毒藥物人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞）。日本Oncolys公司的Telomelysin TM（OBP-301）溶瘤病毒是刪除了E1A區(qū)前端的啟動(dòng)子并替換上了TERT腫瘤特異性啟動(dòng)子，從而使得該腺病毒可以在腫瘤細(xì)胞中特異復(fù)制，并對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯不良反應(yīng)[8]。溶瘤腺病毒CG0070插入了腫瘤特異性啟動(dòng)子TERT和GM-CSF基因，從而使得改造后的溶瘤腺病毒可以特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，伴隨腫瘤細(xì)胞的裂解會(huì)釋放出GM-CSF因子和腫瘤特異性抗原，從而刺激人體全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)[9-10]。

2.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向型溶瘤腺病毒

轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向型溶瘤腺病毒相對(duì)于非轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向型溶瘤腺病毒，其腫瘤特異性更強(qiáng)，安全性更高，且易于體內(nèi)清除。其原理是在刪除或替換了腺病毒的某些毒性基因的同時(shí)，人為改造并優(yōu)化了其抗原表位結(jié)構(gòu)域，如fiber蛋白的RGD，從而減少了其感染正常細(xì)胞的幾率，降低了治療的不良反應(yīng)。目前，進(jìn)入臨床Ⅱ期的DNX-2401溶瘤腺病毒，其原理是在E1A區(qū)缺失了24 bp堿基，因此其可以特異性地在RB基因突變的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，同時(shí)對(duì)該腺病毒Fiber基因的Hloop區(qū)段進(jìn)行了RGD修飾，從而使得修飾后的溶瘤腺病毒可以與特異性表達(dá)整合素αvβ3和αvβ5的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合并發(fā)揮作用[11]。

3 腺病毒溶瘤作用機(jī)制

腺病毒進(jìn)入機(jī)體后，對(duì)腫瘤的作用有4個(gè)：第一是直接殺傷作用。正常細(xì)胞清除病毒的信號(hào)通路包括IFN、TLR、JAK-STAT、PKR等[12-13]，當(dāng)病毒感染正常細(xì)胞后，該通路被激活，進(jìn)而結(jié)合免疫反應(yīng)達(dá)到清除病毒的目的。癌細(xì)胞相比于正常細(xì)胞，其信號(hào)傳導(dǎo)及內(nèi)環(huán)境平衡存在異常，當(dāng)諸如RAS、TP53、RB1和PTEN等基因發(fā)生突變后，使得癌細(xì)胞更易被病毒感染[14]，因此通過(guò)刪除腺病毒與該類蛋白相互作用的非必需基因，如E1區(qū)55 kD基因的腺病毒，可以使其選擇性地在腫瘤細(xì)胞中大量增殖并裂解腫瘤細(xì)胞[9]。第二是介導(dǎo)腫瘤免疫反應(yīng)。腺病毒可以打破腫瘤的免疫逃避機(jī)制，即當(dāng)腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后，其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的病毒蛋白，以及干擾細(xì)胞的正常代謝而產(chǎn)生的異常蛋白與腫瘤表面的組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原形成復(fù)合物，從而改變腫瘤表面抗原特性、介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞識(shí)別并特異性攻擊感染了病毒的腫瘤細(xì)胞[15]。第三是腫瘤免疫清除作用。當(dāng)溶瘤腺病毒感染并殺傷腫瘤細(xì)胞及其基質(zhì)細(xì)胞后，會(huì)使腫瘤細(xì)胞裂解并釋放出大量的腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen， TSA），從而激起全身性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。第四是載體作用。腺病毒在刪除某些毒性基因的同時(shí)可以作為載體插入目的基因，在目的基因的表達(dá)產(chǎn)物與溶瘤腺病毒的協(xié)同作用下，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

4 已上市及進(jìn)入臨床的溶瘤病毒藥物

全世界首個(gè)溶瘤腺病毒新藥在2005年被批準(zhǔn)上市，以鼻咽癌為主要適應(yīng)證的人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞），該藥為中國(guó)原研藥，其治療腫瘤效果明顯、不良反應(yīng)小、安全性高。目前，中國(guó)處于臨床試驗(yàn)研究的溶瘤腺病毒藥物為成都康弘生物科技有限公司的選擇性溶瘤重組腺病毒注射液KH901，處于臨床Ⅱ期招募階段，其主要適應(yīng)證為頭頸部腫瘤。國(guó)外關(guān)于溶瘤腺病毒治療藥物的臨床研究共44個(gè)，主要分布于歐洲、美國(guó)和加拿大，其中處于臨床Ⅰ期的試驗(yàn)共25個(gè)，處于臨床Ⅱ期的試驗(yàn)共11個(gè)，處于臨床Ⅲ期的試驗(yàn)1個(gè)。具有代表性的是Cell Genesys公司開發(fā)的溶瘤腺病毒藥物CG0070，目前該藥物已處于臨床Ⅲ期，主要治療非肌肉性浸潤(rùn)膀胱癌[16]；DNAtrix公司的溶瘤腺病毒DNX-2401，目前處于臨床Ⅱ期，該藥的主要機(jī)理是利用avb3或avb5進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)而治療腦膠質(zhì)瘤[11]；ángel Montero Carcaboso設(shè)計(jì)的溶瘤腺病毒VCN-01，對(duì)抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，并對(duì)眼癌具有良好的治療效果[17]。

5 治療策略

目前，溶瘤腺病毒治療的給藥方式主要為瘤內(nèi)注射，靜脈注射給藥方式較少，因?yàn)殪o脈注射往往會(huì)引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，使得病毒感染腫瘤細(xì)胞之前已被免疫系統(tǒng)排除殆盡而達(dá)不到溶瘤目的，因此單次或多次瘤內(nèi)、瘤外精確用藥，使其特異性裂解腫瘤細(xì)胞，激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，是主要的治療方式[18]。有報(bào)道臨床上先通過(guò)手術(shù)摘除膀胱癌腫瘤，再通過(guò)導(dǎo)管將溶瘤腺病毒（CG0070）注射到膀胱，起到了較為理想的治療效果[16]；DNX-2401局部給藥后治療腦膠質(zhì)瘤的效果明顯[11]。安柯瑞結(jié)合經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，通過(guò)經(jīng)腫瘤動(dòng)脈注射H101的方式，可以有效治療不可切除性的肝細(xì)胞癌[19]。因此，摸索不同溶瘤病毒的最佳給藥方式，精確給藥，對(duì)溶瘤病毒的治療效果至關(guān)重要[20]。

由于溶瘤腺病毒為可復(fù)制性腺病毒，因此其抗干擾能力強(qiáng)，可以協(xié)同放化療、單抗治療、細(xì)胞治療、中藥治療等多種治療方法。如預(yù)注射表達(dá)IL-7/IL-12的溶瘤病毒，極大增強(qiáng)了PD-1抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4）抗體的治療效果[21]。有報(bào)道稱，表達(dá)IL-15的溶瘤腺病毒Ad-E2F/IL15與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte， CTL）治療方法連用，對(duì)腫瘤的治療效果明顯大于單獨(dú)使用CTL或者Ad-E2F/IL15，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[22]。溶瘤病毒ONCOS-102聯(lián)合PD1治療難治性晚期黑色素瘤，觀察到患者血液中促炎性細(xì)胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）α、IFN-γ等系統(tǒng)性增加，并引起了強(qiáng)效的全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)[23]。H101聯(lián)合化療可以有效治療晚期腫瘤[24]。

使用溶瘤病毒的治療策略多種多樣，使用溶瘤腺病毒治療時(shí)，要根據(jù)具體腫瘤的類型、腫瘤灶的部位，腫瘤的擴(kuò)散程度等合理用藥，因此更科學(xué)的治療方法仍需要探索，但從初步治療效果可見，其治療效果較為理想。

6 擬解決問(wèn)題及展望

腺病毒作為溶瘤病毒載體具有極大的潛力，給惡性腫瘤的治療帶來(lái)了新的思路與希望，但目前仍有許多問(wèn)題需要解決，如腫瘤特異性問(wèn)題。目前上市或在研的產(chǎn)品中，絕大多數(shù)為特異性瘤內(nèi)復(fù)制型溶瘤腺病毒，部分正常細(xì)胞雖然感染后不利于溶瘤腺病毒的復(fù)制，但是會(huì)表達(dá)毒性因子并引起不良反應(yīng)，因此尋找廣譜性腫瘤特異性靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)出能夠特異性感染腫瘤細(xì)胞的溶瘤腺病毒，是未來(lái)研究的一個(gè)方向。

目前溶瘤腺病毒給藥方式多為瘤內(nèi)注射，但機(jī)體深處的腫瘤如腦膠質(zhì)瘤，很難直接瘤內(nèi)注射，該用藥方式極大限制了溶瘤腺病毒的臨床應(yīng)用范圍，為了解決該難題，靜脈注射給藥是一個(gè)治療思路，但是，由于靜脈注射極易引起強(qiáng)烈的免疫清除反應(yīng)，被血液稀釋后的病毒很難精確浸潤(rùn)到腫瘤部位，靜脈高劑量注射溶瘤腺病毒存在潛在安全風(fēng)險(xiǎn)如細(xì)胞因子風(fēng)暴等問(wèn)題，因此，探索新的給藥方式，新的載體形式，降低機(jī)體免疫反應(yīng)，是溶瘤腺病毒未來(lái)急需解決的一個(gè)問(wèn)題。

為了提高對(duì)腫瘤的選擇殺傷性，降低不良反應(yīng)，選擇腫瘤特異性啟動(dòng)子是一個(gè)設(shè)計(jì)思路，雖然該辦法可以明顯提高溶瘤病毒的特異性，但是由于啟動(dòng)子的活性普遍較低而使得溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞中增殖能力較弱，進(jìn)而大大降低了其溶瘤效果。因此尋找特異性強(qiáng)，活性高的腫瘤特異性啟動(dòng)子是未來(lái)研究的一個(gè)方向。

作為溶瘤病毒類產(chǎn)品，同時(shí)要考慮生物安全性問(wèn)題，如改造后的病毒是否穩(wěn)定，是否與野毒重組而形成新的自然界未有的病毒，攜帶的基因是否可以穩(wěn)定表達(dá)，至今無(wú)數(shù)據(jù)支持。改造的病毒執(zhí)行功能后，是否可以被機(jī)體完全清除，治療過(guò)的患者是否會(huì)成為傳染源而感染正常人等問(wèn)題，需要精確的檢測(cè)方法和相應(yīng)的安全性評(píng)價(jià)體系。有報(bào)道稱cidofovir（CDV）可以有效阻止OBP-301溶瘤腺病毒的體內(nèi)復(fù)制，因此尋找抗病毒藥物是提高溶瘤腺病毒安全性的一個(gè)設(shè)計(jì)思路[25]。

雖然腺病毒易于進(jìn)入細(xì)胞，在被感染的細(xì)胞內(nèi)可以充分持續(xù)的表達(dá)外源基因，且不易整合到宿主基因組，但是腺病毒的基因組大小約為33 kb，外源基因載量小，約為5 kb，因此極大地限制了其溶瘤病毒的應(yīng)用范圍。

綜上所述，溶瘤腺病毒雖然存在一些問(wèn)題亟待解決，但其治療效果值得肯定，是一種有前途的腫瘤免疫療法。目前，優(yōu)化溶瘤腺病毒的構(gòu)建、降低其臨床的毒性、建立高效遞送體系、建立安全可靠的生物安全評(píng)價(jià)體系，是急需解決的問(wèn)題。單一溶瘤腺病毒療法可能較為局限，溶瘤腺病毒療法與其它腫瘤療法的聯(lián)合運(yùn)用，是未來(lái)運(yùn)用的一個(gè)方向。隨著人們對(duì)腫瘤和病毒的不斷認(rèn)識(shí)，不斷引進(jìn)新的設(shè)計(jì)理念，注重生物安全，相信溶瘤病毒具有廣闊的應(yīng)用前景。

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