黃芪多糖中抗炎組分的結(jié)構(gòu)及其活性的初步研究

范信暉,李 科,,楊一丹,秦雪梅,李震宇,李雪琴(山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 00006;山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所;通訊作者,E-mail:like@sxu.edu.cn)

中藥黃芪是多年生豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。性味甘,微溫,歸脾、肺經(jīng),具有補(bǔ)脾益氣、利水消腫、托毒生肌功效;為補(bǔ)藥之長(zhǎng)[2]。

本草考證發(fā)現(xiàn),黃芪尚能夠治療傷寒、熱病、瘰疬痰嗽、瘧疾、骨蒸潮熱、霍亂嘔吐、痘疹等病癥,但這些病癥在歷版《中國(guó)藥典》中未被收載,而目前在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用的利水消腫、生津養(yǎng)血等免疫促進(jìn)功能在古代本草中并非主要功效,不占主導(dǎo)地位[3]?！段迨》健肥悄壳鞍l(fā)現(xiàn)最早記載黃芪主治的典籍,云“黃芪治療疽病,肉疽則倍用”;《神農(nóng)本草經(jīng)》中將黃芪列為上品,言其“味甘微溫,主癰疽久敗創(chuàng),排膿止痛,大風(fēng),痢疾,五痔,鼠瘺,補(bǔ)虛,小兒百病”;表明古人最早使用黃芪用于治療疽病。現(xiàn)代研究表明,疽病的發(fā)病機(jī)制與西醫(yī)所指的炎癥密切相關(guān),表明黃芪應(yīng)該具有抗炎等免疫抑制功能;即黃芪具有免疫雙向調(diào)節(jié)作用[4]。

黃芪多糖是黃芪藥材中含量最多、免疫活性最強(qiáng)的一類(lèi)物質(zhì)[5]。大量研究表明,黃芪多糖具有免疫雙向調(diào)節(jié)功能,已在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平得到驗(yàn)證[6-10]。然而目前黃芪多糖的研究大多以黃芪總多糖作為研究對(duì)象,究竟是黃芪多糖中哪些分子量多糖在起免疫促進(jìn)功能,哪些分子量多糖具有免疫抑制活性,或者兼具免疫促進(jìn)和免疫抑制活性?這些方面鮮見(jiàn)報(bào)道,也是黃芪多糖創(chuàng)新藥物研發(fā)亟需解決的問(wèn)題。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),黃芪總多糖的分子量分布主要分為兩個(gè)部分,由APS-Ⅰ(大于2 000 kD)和APS-Ⅱ(10 kD)組成;通過(guò)超濾膜分離手段將兩個(gè)組分分離制備,并通過(guò)細(xì)胞篩選和動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)APS-Ⅱ是起免疫促進(jìn)作用的主要組分[11,12],而兩個(gè)組分在免疫抑制過(guò)程中的藥理作用尚不清楚。

因此,本研究采用水提醇沉法提取山西渾源黃芪中的多糖成分,采用超濾膜截留法將APS截取得到APS-Ⅰ和APS-Ⅱ,運(yùn)用光譜、色譜以及質(zhì)譜等方法對(duì)APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞株RAW264.7建立細(xì)胞炎癥模型,以此評(píng)價(jià)APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的抗炎活性。本研究對(duì)于探明黃芪抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ),也為黃芪多糖的藥物開(kāi)發(fā)準(zhǔn)備了條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(依利特P230);Waters 2695液相色譜儀;示差折光檢測(cè)器(RID);2489紫外檢測(cè)器;CPA225D萬(wàn)分之一電子天平;Neofuge13R高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司);SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);ZX-LGJ-18普通型冷凍干燥機(jī)(上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng));Trace PolarisQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Finnigan公司);Bruker Tensor27型紅外光譜儀;Bruker 600-MHz Avance Ⅲ NMR Spectrometer(瑞士,布魯克公司);Chirascan V100圓二色光譜儀(英國(guó)應(yīng)用光物理公司)。

1.1.2 試劑 山西渾源黃芪(仿野生蒙古黃芪),山西大學(xué)秦雪梅教授鑒定為蒙古黃芪的干燥根(2017年采收,生長(zhǎng)年限5年)。藥材樣品留存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心樣品庫(kù)。系列相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)右旋糖酐對(duì)照品(Mr:180,2 500,7 100,10 000,21 400,41 100,84 400,133 800及2 000 000,中國(guó)食品藥品檢定研究院);葡萄糖(Glu),半乳糖(Gal),半乳糖醛酸(GalA),鼠李糖(Rha),甘露糖(Man),巖藻糖(Fuc),阿拉伯糖(Ara)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)(純度大于98%;山西玖玖商貿(mào)有限公司);木瓜蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司(美國(guó));三氟乙酸(TFA,純度大于99%;中國(guó)上海阿拉丁);氘代硼氫化鈉(NaBD4)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自阿拉丁(中國(guó)上海);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP,純度大于99%;國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);分析級(jí)甲醇、無(wú)水乙醇、氯仿及正丁醇均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);色譜級(jí)乙腈為美國(guó)Thermo公司。所有其他試劑均為分析級(jí)。RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞從ATCC獲得,MTT、澳洲胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS磷酸鹽緩沖液、脂多糖均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 APS的提取

參考文獻(xiàn)[13]方法提取APS,黃芪粉末過(guò)100目篩后取黃芪細(xì)粉15 g,以1 ∶20比例加入去離子水,90 ℃下磁力攪拌器攪拌提取4 h,離心取上清液濃縮至150 ml,酶解法結(jié)合三氯乙酸法除蛋白(加入200 U木瓜蛋白酶,45 ℃下水浴6 h,隨后加10%三氯乙酸至總體積200 ml,冰浴中攪拌15 min后靜置30 min,離心棄沉淀)。離心后上清液中緩緩加入無(wú)水乙醇至最終醇濃度為80%,靜置過(guò)夜,沉淀冷凍干燥得APS。

1.3 APS的分離

根據(jù)APS的分子量分布特點(diǎn),采用超濾膜截留法進(jìn)行分離,可將APS分為2個(gè)部分。第一部分分子量大于2 000 kDa(超出線(xiàn)性范圍),第二部分的分子量為10 kD。將APS配制成5 mg/ml的溶液,并通過(guò)分子截留量為100 kD的超濾膜將APS分為>2 000 kD(APS-Ⅰ)和10 kD(APS-Ⅱ)兩個(gè)組分。截流后,將這2個(gè)部分冷凍干燥,計(jì)算得率。

1.4 總糖含量測(cè)定

采用苯酚硫酸法對(duì)總糖含量進(jìn)行測(cè)定[14]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作:精密量取100 μg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1 ml,分別置于試管中加水至1 ml,然后加入5%苯酚溶液1 ml,濃硫酸5 ml,各管加完浸于沸水浴中煮沸5 min后取出,用冰浴冷卻至室溫。在485 nm波長(zhǎng)下以0 μg/ml為空白,測(cè)定其余各管吸光度。以葡萄糖含量(μg)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到葡萄糖的線(xiàn)性回歸方程為y=4.712 7x+0.062 2,R2=0.994 5。

多糖含量測(cè)定:將樣品配制成100 μg/ml的溶液。精密吸取供試品1.0 ml,按上述方法平行測(cè)定3次,將測(cè)得的吸光度帶入方程,即得樣品的總糖含量。

1.5 糖醛酸含量測(cè)定

采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量[14],標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備:取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 ml的葡萄糖醛酸溶液于試管中,然后加水到1.0 ml。在冰水中預(yù)冷后加入6 ml Na2B4O7硫酸溶液,渦旋。在沸水浴中反應(yīng)12 min。冰浴至室溫,分別加入間羥基聯(lián)苯溶液120 μl,渦旋,室溫放置40 min,525 nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖醛酸溶液濃度為橫軸,525 nm處的吸光度為縱軸,作圖,得到葡萄糖醛酸的線(xiàn)性回歸方程y=4.411 9x+0.075 1,R2=0.992 4。

樣品測(cè)定:將樣品配制成100 μg/ml的溶液。精密吸取供試品1.0 ml,按上述方法平行測(cè)定3次,將測(cè)得的吸光度帶入方程,即得樣品的糖醛酸含量。

1.6 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作:取系列相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)右旋糖酐對(duì)照品,分別加純水稀釋成5 mg/ml的對(duì)照品溶液,每針進(jìn)樣10 μl,流動(dòng)相為純水,流速為1.0 ml/min,柱溫35 ℃,色譜柱為T(mén)SK gel GMPWXL凝膠柱(300 mm×7.8 mm,13 μm)(日本Tosoh Corporation公司),示差折光檢測(cè)器34 ℃,測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。以保留時(shí)間tR為橫坐標(biāo),lgMw為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到右旋糖酐對(duì)照品線(xiàn)性回歸方程lgMw=-0.782tR+12.451,R2=0.999 8。

樣品分子量測(cè)定:分別精密稱(chēng)取多糖樣品5 mg,配制成濃度約為5 mg/ml的樣品溶液,每針進(jìn)樣10 μl,流動(dòng)相為純水,流速為1 ml/min,柱溫35 ℃,示差檢測(cè)器34 ℃,測(cè)得各樣品的保留時(shí)間。所得保留時(shí)間由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算分子量。

1.7 結(jié)構(gòu)分析

1.7.1 單糖組成分析 參照文獻(xiàn)[15]方法,對(duì)多糖樣品進(jìn)行水解和衍生化,并采用PMP柱前衍生化-高效液相色譜法(HPLC-UV)法測(cè)定其單糖組成。

多糖的水解:稱(chēng)取5 mg多糖樣品置于水解管中,加2 mol/L三氟乙酸3 ml溶解混勻,密封,置于110 ℃烘箱中加熱水解3 h。取出,放置冷至室溫后,轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,濃縮至干。減壓條件下反復(fù)加入2 ml甲醇,重復(fù)3次,去除殘余的三氯乙酸。最后將水解產(chǎn)物溶于1 ml純水中,備用。

單糖對(duì)照品的衍生化:參照文獻(xiàn)[15]方法配制10 mmol/L的單糖混合對(duì)照品溶液,取混合標(biāo)品0.2 ml至2 ml的EP管中,與0.24 ml 0.5 mol/L的PMP及0.2 ml 0.3 mol/L的NaOH溶液混合放置于恒溫金屬浴中,70 ℃、300 r/min反應(yīng)70 min。冷卻至室溫后加入0.2 ml 0.3 mol/L的HCl進(jìn)行中和反應(yīng),加入1 ml氯仿萃取,離心棄去有機(jī)層,重復(fù)萃取3次,得到上層水液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),供HPLC進(jìn)樣。

多糖樣品的衍生化:精密吸取多糖水解液0.2 ml按照“單糖對(duì)照品的衍生化”項(xiàng)下方法處理后即得,供HPLC進(jìn)樣。

HPLC-UV檢測(cè)條件:色譜柱為Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm;中國(guó)天津博納艾杰爾科技有限公司);流動(dòng)相A相為磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6.7,50 mmol/L;B相為乙腈,按A ∶B=82 ∶18等度洗脫;流速1.0 ml/min;柱溫35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm;進(jìn)樣量20 μl。

1.7.2 甲基化分析 精密稱(chēng)取APS-Ⅰ和APS-Ⅱ樣品5 mg;參考文獻(xiàn)[16]方法,對(duì)APS-Ⅰ和APS-Ⅱ進(jìn)行甲基化,通過(guò)IR確定甲基化程度,甲基化完成后,進(jìn)行酸水解、還原和乙酰化衍生,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行分析。

氣相條件:以DB-5MS毛細(xì)管柱為氣相色譜柱,入口溫度220 ℃;載氣:高純氦,載氣流量:1.0 ml/min,分流設(shè)為10 ∶1;溫度變化:起點(diǎn)溫度是100 ℃;以5 ℃/min升溫到180 ℃,1 min;以1 ℃/min升溫到190 ℃,2 min;以30 ℃/min升溫到220 ℃,2 min;以1 ℃/min升溫到230 ℃,2 min;以20 ℃/min升溫到280 ℃,10 min。

質(zhì)譜條件:參照文獻(xiàn)[17],電離源:電子轟擊源(EI);離子源溫度:220 ℃;傳輸線(xiàn)溫度250 ℃;掃描模式為全掃描;掃描范圍:m/z30-550。

1.7.3 紅外光譜分析 取APS-Ⅰ和APS-Ⅱ樣品(2 mg)與KBr粉末混合,壓制成片,掃描波長(zhǎng)范圍在4 000-450 cm-1之間。

1.8 黃芪多糖的抗炎活性實(shí)驗(yàn)

1.8.1 MTT法檢測(cè)藥物毒性 參考文獻(xiàn)[18]的方法并做適當(dāng)修改,用含10% FBS胎牛血清的完全培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔104個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔板,每孔體積100 μl。在5% CO2,37 ℃條件下孵育24 h,屆時(shí)細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底。24 h后給藥,實(shí)驗(yàn)分為:空白組,APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ多糖給藥組,多糖給藥組濃度梯度分別為10,25,50,100,250,500 μg/ml。每個(gè)濃度的藥物設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。給藥完成后,于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。次日取出96孔板,向含細(xì)胞的96孔板中每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT試劑,再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。4 h后小心吸棄MTT試劑,向每孔中加入100 μl DMSO試劑。室溫下用搖床振蕩10 min,再于酶標(biāo)儀490 nm下檢測(cè)每孔吸光度。

1.8.2 ELISA法檢測(cè)IL-10、NO和TNF-α的水平 用含10% FBS胎牛血清的完全培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔104個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔板,每孔體積100 μl。在5% CO2,37 ℃條件下孵育24 h,屆時(shí)細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底。設(shè)置空白組,炎癥模型組,以及APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ多糖給藥組(濃度梯度分別為10,25,50,100 μg/ml),每組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,藥物預(yù)干預(yù)2 h后,炎癥模型組與多糖給藥組加入適量LPS,使得LPS終濃度為1 μg/ml,對(duì)照組加入等量的PBS后繼續(xù)培養(yǎng)24 h;24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)基上清液,1 000g,4 ℃,離心15 min,取上清液,根據(jù)ELISA試劑盒和NO快速檢測(cè)盒的說(shuō)明測(cè)定IL-10、NO和TNF-α的生成量。

1.8.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Prism 7.00軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總糖含量及糖醛酸含量測(cè)定

APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ總糖含量分別為88.2%,74.4%,79.5%;糖醛酸含量分別為11.9%,27.2%,4.6%。

2.2 APS的分離及分子量測(cè)定

APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的分子量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)80%醇沉得到黃芪總多糖APS包含兩個(gè)不同分子量多糖APS-Ⅰ(大于2 000 kD)和APS-Ⅱ(10 kD),采用超濾膜截留法將APS截取得到APS-Ⅰ和APS-Ⅱ(見(jiàn)圖1)。

2.3 黃芪多糖單糖組成測(cè)定

根據(jù)單糖混合對(duì)照品圖譜與樣品黃芪單糖特征圖譜進(jìn)行對(duì)比,可以確定APS-Ⅰ和APS-Ⅱ均由Rha,GalA,Glu,Gal和Ara 5種單糖組成(見(jiàn)圖2,3),但各單糖在A(yíng)PS-Ⅰ和APS-Ⅱ中所占的比例有所區(qū)別。以阿拉伯糖的物質(zhì)的量為1,APS-Ⅰ中Rha,GalA,Glu,Gal,Ara的比例約為0.1 ∶0.39 ∶17.2 ∶13.4 ∶1;在A(yíng)PS-Ⅱ中約為0.14 ∶0.14 ∶24.04 ∶9.6 ∶1。

1.甘露糖;2.鼠李糖;3.半乳糖醛酸;4.N-乙酰氨基葡萄糖;5.葡萄糖;6.半乳糖;7.阿拉伯糖;8.巖藻糖圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-UV色譜圖Figure 2 Chromatogram of sugar standards by HPLC-UV

2.4 黃芪多糖紅外光譜分析

兩種多糖的紅外光譜見(jiàn)圖4,APS-Ⅰ在3 413.04 cm-1處的吸收峰屬于-OH的伸縮振動(dòng);在3 004.74 cm-1,2 970.30 cm-1處的吸收峰是由于C-H鍵的拉伸振動(dòng)引起的;1 715.86 cm-1處的吸收峰歸因于C=O的伸縮振動(dòng),提示APS-Ⅰ中存在糖醛酸;1 421.09 cm-1和1 363.76 cm-1的吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動(dòng);1 220.07 cm-1的吸收峰歸因于C-O-C的伸縮振動(dòng);1 092.28 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖環(huán);901.29 cm-1和785.5 cm-1的吸收峰屬于β型糖苷鍵;即APS-Ⅰ以β型吡喃糖苷鍵為主。APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的紅外光譜相似度很高,除含有糖的特征官能團(tuán)吸收峰外,APS-Ⅱ在1 092.25 cm-1和530.28 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖環(huán);901.26和814.74 cm-1處的峰分別表明存在β和α-糖苷鍵。綜上,APS-Ⅰ以β型糖苷鍵為主;APS-Ⅱ同時(shí)包含α型糖苷鍵和β型糖苷鍵;且二者結(jié)構(gòu)中均含有糖醛酸。

2.5 黃芪多糖甲基化分析

APS-Ⅰ和APS-Ⅱ甲基化分析的GC-MS總離子色譜圖見(jiàn)圖5。通過(guò)將甲基化多糖的離子碎片特征與CCRC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html)比較,得到APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的連接方式(見(jiàn)表1,2)。APS-Ⅰ單糖殘基連接方式為→4)-L-Ara-(1→,→2)-D-Gal-(1→,→4)-L-Rha-(1→,→6)-D-Glu-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-D-Glu-(1→;APS-Ⅱ單糖殘基連接方式為→4)-L-Ara-(1→,→3,4)-D-Gal-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-D-Glu-(1→。

表1 APS-Ⅰ甲基化結(jié)果分析Table 1 Results of methylation analysis of APS-Ⅰ

2.6 MTT法檢測(cè)藥物毒性結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法考察了APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ不同濃度下對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響,結(jié)果顯示,3個(gè)組分在0-100 μg/ml下與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h無(wú)明顯毒性(見(jiàn)圖6),因此可在0-100 μg/ml范圍內(nèi)選取合適濃度進(jìn)行后續(xù)炎癥因子的測(cè)定。

與0 μg/ml相比,*P<0.05圖6 不同濃度APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 6 Effect of different concentrations of APS, APS-Ⅰ and APS-Ⅱ on cell viability by MTT assay

表2 APS-Ⅱ甲基化結(jié)果分析Table 2 Results of methylation analysis of APS-Ⅱ

2.7 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型的建立

LPS作用24 h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察,空白組細(xì)胞體積較小,呈邊緣明亮的類(lèi)圓形,偶有細(xì)長(zhǎng)觸角,符合巨噬細(xì)胞形態(tài)(見(jiàn)圖7A);當(dāng)經(jīng)1 μg/ml LPS刺激24 h后,模型組細(xì)胞體積明顯增大并伸出大量偽足,細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形狀(見(jiàn)圖7B)。

圖7 1 μg/ml LPS刺激24 h后RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)改變Figure 7 Morphological changes of RAW264.7 macrophages after stimulation with 1 μg/ml LPS for 24 h

2.8 APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ?qū)π∈髥魏司奘杉?xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖及分泌NO、TNF-α和IL-10的影響

與空白組相比,LPS模型組NO、TNF-α和IL-10的產(chǎn)生顯著增加(P<0.05,見(jiàn)圖8),說(shuō)明LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞炎癥模型可以成功構(gòu)建。

由圖8可知,APS和APS-Ⅰ均可抑制LPS模型組產(chǎn)生NO。APS為100 μg/ml時(shí),抑制NO產(chǎn)生的作用最強(qiáng);APS-Ⅰ為100 μg/ml時(shí),抑制NO產(chǎn)生的作用最強(qiáng)。APS和APS-Ⅰ最佳劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),均能顯著抑制NO的產(chǎn)生。APS-Ⅱ可促進(jìn)LPS模型組產(chǎn)生NO,APS-Ⅱ?yàn)?00 μg/ml時(shí),促進(jìn)NO產(chǎn)生的作用最強(qiáng),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同分子量組分抑制NO產(chǎn)生的活性順序?yàn)锳PS-Ⅰ>APS>APS-Ⅱ。

與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05圖8 APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ?qū)AW264.7細(xì)胞釋放NO的影響Figure 8 Effects of APS, APS-Ⅰ and APS-Ⅱ on NO in RAW264.7 cells

由圖9可知,APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ均可抑制LPS模型組產(chǎn)生TNF-α。APS為100 μg/ml時(shí),抑制TNF-α產(chǎn)生的作用最強(qiáng);APS-Ⅰ為100 μg/ml時(shí),抑制TNF-α產(chǎn)生的作用最強(qiáng);APS-Ⅱ?yàn)?0 μg/ml時(shí),抑制TNF-α產(chǎn)生的作用最強(qiáng)。APS和APS-Ⅰ最佳劑量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),均能顯著抑制TNF-α的產(chǎn)生。不同分子量組分抑制TNF-α產(chǎn)生的活性順序?yàn)锳PS-Ⅰ>APS>APS-Ⅱ。

與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05圖9 APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ?qū)AW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響Figure 9 Effects of APS, APS-Ⅰ and APS-Ⅱ on TNF-α in RAW264.7 cells

由圖10可知,APS在0-50 μg/ml時(shí)可以促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生。APS為25 μg/ml時(shí),促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的作用最強(qiáng),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APS在50-100 μg/ml時(shí)可以抑制IL-10的產(chǎn)生。APS為100 μg/ml時(shí),抑制IL-10產(chǎn)生的作用最強(qiáng),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APS-Ⅰ可促進(jìn)LPS模型組產(chǎn)生IL-10。APS-Ⅰ為50 μg/ml時(shí),促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的作用最強(qiáng),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APS-Ⅱ可抑制LPS模型組產(chǎn)生IL-10。APS為100 μg/ml時(shí),抑制IL-10產(chǎn)生的作用最強(qiáng);與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同分子量組分促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的活性順序?yàn)锳PS-Ⅰ>APS>APS-Ⅱ。

綜上所述,APS-Ⅰ的體外抗炎活性?xún)?yōu)于A(yíng)PS-Ⅱ。

3 討論

黃芪多糖是黃芪藥材中含量最多、免疫活性最強(qiáng)的一類(lèi)物質(zhì)。大量研究表明,黃芪多糖具有免疫雙向調(diào)節(jié)功能[5-10]。然而目前的研究大多以黃芪總多糖作為研究對(duì)象,并未進(jìn)行分離制備。課題組前期根據(jù)黃芪多糖主要由兩組不同分子量多糖部位組成的特點(diǎn),通過(guò)超濾膜分離手段將兩個(gè)組分分離制備,得到APS-Ⅰ(分子量大于2 000 kD)和APS-Ⅱ(分子量約為10 kD)兩個(gè)組分,并從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平篩選出了APS-Ⅱ是發(fā)揮免疫促進(jìn)作用的主要組分;而兩個(gè)組分在免疫抑制過(guò)程中的藥理作用尚不清楚。

大量研究表明,結(jié)構(gòu)是影響多糖發(fā)揮生物活性的主要因素[19]。因此,本文從結(jié)構(gòu)表征以及抗炎活性?xún)蓚€(gè)方面對(duì)分離得到的兩種多糖進(jìn)行了研究。

本研究結(jié)果顯示,多糖結(jié)構(gòu)分析顯示:APS-Ⅰ(大于2 000 kD)和APS-Ⅱ(10 kD)分子量差異明顯。從單糖組成上看,二者均由Rha,Gal A,Gal,Glu和Ara 5種單糖組成,但是其單糖含量比例差異明顯,APS-Ⅰ中Gal A和Gal的比例要遠(yuǎn)高于A(yíng)PS-Ⅱ;糖醛酸含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),APS-Ⅰ糖醛酸含量遠(yuǎn)高于A(yíng)PS-Ⅱ,約為其6倍,與單糖組成結(jié)果一致。紅外光譜一般可以得到多糖取代官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)與位置,糖殘基構(gòu)型等,APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的紅外光譜相似度很高,除含有糖的特征官能團(tuán)吸收峰外,二者結(jié)構(gòu)中均含有糖醛酸,與文獻(xiàn)結(jié)果一致[20-23]。甲基化分析可知,二者具有不同的糖連接方式,APS-Ⅰ主要的連接方式為→4)-D-Glu-(1→,→6)-D-Gal-(1→和→4)-L-Ara-(1→,APS-Ⅱ主要的連接方式為→4)-D-Glu-(1→,→3,6)-D-Glu-(1→和→3,4)-D-Gal-(1→。

多糖抗炎活性分析顯示:NO是炎癥反應(yīng)中生成的重要炎癥因子,介導(dǎo)炎癥等疾病的發(fā)生,其含量可以作為炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)[24],APS-Ⅰ在質(zhì)量濃度為0-100 μg/ml時(shí)顯著抑制NO的產(chǎn)生,抑制效果優(yōu)于A(yíng)PS-Ⅱ。TNF-α是炎癥反應(yīng)中主要促炎細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,具有重要的生物功能[25],本研究結(jié)果顯示,APS-Ⅰ在質(zhì)量濃度為0-100 μg/ml時(shí)顯著抑制TNF-α的產(chǎn)生,抑制效果優(yōu)于A(yíng)PS-Ⅱ。IL-10是一種多細(xì)胞源性的細(xì)胞因子,其中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞是其主要來(lái)源細(xì)胞。在控制病原體和微生物造成的炎癥反應(yīng)中,IL-10具有抗炎、免疫抑制、負(fù)反饋調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能[26],本研究結(jié)果顯示,APS-Ⅰ在質(zhì)量濃度為0-100 μg/ml時(shí)顯著促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生,促進(jìn)效果優(yōu)于A(yíng)PS-Ⅱ。由此可知,APS-Ⅰ的體外抗炎活性?xún)?yōu)于A(yíng)PS-Ⅱ。

近年來(lái)有研究表明,酸性多糖具有較好的抗炎活性。袁雷等[27]從血滿(mǎn)草中分離得到一種酸性多糖SPS-1,并對(duì)其進(jìn)行硫酸化修飾得到SSPS-1,體外抗炎實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),二者均可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌,并能顯著增加抗炎因子IL-10的分泌。朱燕等[28]從蘆薈中分離得到一種酸性多糖,并采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型檢測(cè)其抗炎活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆薈酸性多糖對(duì)二甲苯所致的小鼠耳腫脹有明顯的緩解作用,表現(xiàn)出較好的抗炎活性。Kuang等[29]從麻黃根莖中分離得到一種酸性雜多糖,體內(nèi)免疫學(xué)試驗(yàn)表明,麻黃多糖具有低毒和強(qiáng)烈的免疫抑制作用,這可能與其抑制血清中的IL-2和IL-4水平以及降低小鼠血清中的CD4+/CD8+比值。本研究發(fā)現(xiàn)APS-Ⅰ糖醛酸含量遠(yuǎn)高于A(yíng)PS-Ⅱ,約為其6倍,提示這可能是APS-Ⅰ體外抗炎活性?xún)?yōu)于A(yíng)PS-Ⅱ的重要原因。

在課題組前期研究基礎(chǔ)上,本文通過(guò)體外活性篩選實(shí)驗(yàn)找到了APS中抗炎活性較好的主要組分APS-Ⅰ,進(jìn)一步對(duì)APS-Ⅰ的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,一定程度上解釋了APS的抗炎活性構(gòu)效關(guān)系。然而本文也存在一些不足之處,從多糖結(jié)構(gòu)上看,僅僅只從分子量,單糖組成和糖連接方式3個(gè)角度進(jìn)行了解析,后續(xù)可以進(jìn)行糖序列以及高級(jí)結(jié)構(gòu)解析;從多糖抗炎活性上看,僅從細(xì)胞水平上篩選出抗炎組分,后續(xù)應(yīng)在炎癥動(dòng)物模型上驗(yàn)證該結(jié)論,并可以利用多組學(xué)技術(shù)探究APS-Ⅰ發(fā)揮抗炎活性的作用機(jī)制。