miR-27b調(diào)控PINK1/parkin通路參與大鼠癲癇發(fā)作的機(jī)制

楊子茵,黃 軍,李佳宇,曹 西,倪 艷,高安亮(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院神經(jīng)外科,成都 610051;通訊作者,E-mail:3034240438@qq.com)

癲癇作為一種常見(jiàn)的反復(fù)發(fā)作的頑固性疾病,其發(fā)作機(jī)制涉及突觸結(jié)構(gòu)、細(xì)胞死亡、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)及炎癥[1,2]。研究發(fā)現(xiàn),目前所用抗癲癇藥物對(duì)60%的患者有效,40%患者療效不佳,因此尋找有效的治療方法對(duì)提高抗癲癇發(fā)作效果與生存質(zhì)量極其重要[1]。微小RNA作為一個(gè)小型非編碼RNA家族可通過(guò)抑制其靶基因mRNA表達(dá)及翻譯來(lái)調(diào)控多種蛋白質(zhì)的表達(dá)[2]。微小RNA 27b(miR-27b)與腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),降低其表達(dá)可有效改善腦損傷,除此之外miR-27b-3p與神經(jīng)退行性疾病多系統(tǒng)萎縮癥的發(fā)生有關(guān)[3,4]。

自噬在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用,研究發(fā)現(xiàn)其在癲癇應(yīng)激下可起到保護(hù)作用[5]。PTEN誘導(dǎo)性激酶蛋白1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase,Parkin)是一條經(jīng)典的自噬相關(guān)通路,其激活可改善腦損傷大鼠的神經(jīng)元損傷[6]。研究發(fā)現(xiàn)在HeLa宮頸癌細(xì)胞系中,miR-27b對(duì)PINK1的翻譯抑制作用可顯著降低溶酶體對(duì)受損線粒體的自噬清除[7]。目前,關(guān)于miR-27b及PINK1/parkin通路在癲癇中機(jī)制研究還未清楚,因此,本研究通過(guò)探究miR-27b及PINK1/parkin通路在癲癇中的作用機(jī)制,以期為疾病新治療靶點(diǎn)的尋找提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)買(mǎi)80只SPF級(jí)SD大鼠(245-285 g),許可證:SCXK(吉)2016-0004,于正常12 h明暗交替環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,期間自由飲水采食,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 主要試劑

氯化鋰(貨號(hào):0416-100G)購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;HE染色試劑盒(貨號(hào):G1120-100)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;蛋白提取試劑盒(貨號(hào):CD-13559-ML)購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司;BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體(貨號(hào):HR0329-ZHV、JN0200-GLH)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;兔抗β-actin、DRP1、PINK1、parkin、Beclin-1抗體(貨號(hào):4970、8570、6946、2132、3495)購(gòu)自Cell Signaling Technology;兔抗LC3抗體(貨號(hào):NB100-2220)購(gòu)自Novus Biologicals;TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):D1802)購(gòu)自?；锟萍加邢薰?miRNA定量試劑盒(貨號(hào):AMPR-0200)購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia;即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒(貨號(hào):KIT-9901)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;陰性對(duì)照序列(scramble)、miR-27b antagomiR序列由吉瑪基因合成。

CFX384TMTouch熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自伯樂(lè)(Bio-Rad)公司;JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡購(gòu)自日本電子株式會(huì)社;蛋白凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與癲癇模型構(gòu)建 從80只SD大鼠中隨機(jī)選取12只作為對(duì)照組;其余大鼠進(jìn)行模型構(gòu)建:以127 mg/kg氯化鋰進(jìn)行腹腔注射,之后每間隔0.5 h注射30 mg/kg匹羅卡品,直至Racine評(píng)級(jí)達(dá)到4-5級(jí)即為造模成功[8],成功60只,記錄首次注射匹羅卡品至第一次出現(xiàn)Racine評(píng)級(jí)4級(jí)或5級(jí)癲癇發(fā)作所需時(shí)間即潛伏期,并記錄1 h內(nèi)發(fā)作次數(shù);對(duì)照組在模型組同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。將60只大鼠分為模型組、miR-27b NC組、miR-27b拮抗劑組、miR-27b拮抗劑+H89組。對(duì)照組與模型組于造模前2周使用腦立體定位儀于大鼠大腦海馬部雙側(cè)定位注射5 μl生理鹽水;miR-27b NC組注射20 nmol/L拮抗劑陰性對(duì)照5 μl;miR-27b拮抗劑組注射20 nmol/L miR-27b拮抗劑5 μl;miR-27b拮抗劑+H89組注射20 nmol/L miR-27b拮抗劑5 μl及5 mg/kg[9]PINK1上游因子PKA抑制劑H89;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察大鼠行為學(xué)變化。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-27b表達(dá)水平 造模結(jié)束24 h后對(duì)大鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死,取出腦組織。每組選取3只大鼠腦組織,一部分液氮冷凍-80 ℃儲(chǔ)存待Western blot檢測(cè),一部分置于研缽中研磨,通過(guò)Trizol法提取出腦組織樣本中總RNA后檢測(cè)其濃度,以所得RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以其為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,檢測(cè)各組組織中miR-27b的表達(dá)水平;U6作為內(nèi)參,并經(jīng)過(guò)2-ΔΔCt分析表達(dá)水平;引物由Primer 3.0和Oligo 7軟件設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1),由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成(miR-27b下游引物由試劑盒提供)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用qRT-PCR引物Table 1 QRT-PCR primers used in the experiment

1.3.3 HE染色觀察大鼠海馬組織病理學(xué)變化 每組另取5只大鼠,取其海馬組織,并在4%多聚甲醛中固定(24 h)后乙醇脫水、石蠟包埋、切片(4 μm)、二甲苯脫蠟及梯度乙醇處理,再進(jìn)行HE染色、脫水、封片、顯微鏡觀察(n=5)。

1.3.4 透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu) 取其余4只大鼠海馬組織,使用戊二醛固定4 h后再使用四氧化鋨固定2 h,乙醇、丙酮脫水后環(huán)氧樹(shù)脂包埋,切片(0.5 μm),再使用光鏡定位將其制備成超薄切片(60 nm),通過(guò)檸檬酸鋁及醋酸雙氧化鈾染色后選取5個(gè)視野于透射電鏡下觀察。

1.3.5 免疫組化法檢測(cè)DRP1蛋白表達(dá)情況 取2.3所得石蠟切片、梯度乙醇脫蠟、水化后加入雙氧水清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,添加枸緣酸鈉緩沖液(1 000 ml)高壓修復(fù)抗原,DRP1一抗(1 ∶500)過(guò)夜,添加Envision二抗-酶標(biāo)多聚物30 min后PBS清洗,經(jīng)過(guò)DAB顯色顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒、脫水干燥、中性樹(shù)膠封片觀察,呈棕黃色染色即為陽(yáng)性。

1.3.6 Western blot檢測(cè)腦組織PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)情況 將1.3.2所得3只大鼠腦組織(n=3)經(jīng)苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride、PMSF)裂解后提取總蛋白,經(jīng)BCA法檢測(cè)總蛋白含量;取上樣緩沖液與蛋白混勻后100 ℃進(jìn)行5 min變性,以每孔40 μg的量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,低溫轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,5%的脫脂奶粉封閉(1 h)后,按照1 ∶1 000的稀釋度例加入兔抗β-actin、PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ一抗孵育(4 ℃)過(guò)夜,PBS清洗3次后HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶3 000)孵育2 h,添加免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL Reagent)進(jìn)行顯色,蛋白凝膠成像儀觀察,定量分析各蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

對(duì)照組大鼠飲食良好、精神狀態(tài)好、皮毛光潔;模型組和miR-27b NC組大鼠精神萎靡、飲食不佳、體形消瘦、皮毛光澤暗淡臟亂;與模型組相比,miR-27b拮抗劑組大鼠精神狀態(tài)改善、飲食增加、皮毛恢復(fù)光澤;與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組大鼠精神狀態(tài)下降、飲食減少、皮毛暗淡。

2.2 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作潛伏期比較

對(duì)照組大鼠無(wú)癲癇發(fā)作。與模型組相比,miR-27b NC組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組發(fā)作次數(shù)顯著降低,而發(fā)作潛伏期顯著增加(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組發(fā)作次數(shù)顯著增加,發(fā)作潛伏期顯著降低(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作潛伏期比較Table 2 Comparison of seizure frequency and seizure latency of rats in each

2.3 各組大鼠miR-27b表達(dá)水平檢測(cè)

與對(duì)照組相比,模型組腦組織中miR-27b表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與模型組相比,miR-27b NC組miR-27b表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組miR-27b表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組miR-27b表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表3)。

表3 miR-27b表達(dá)情況Table 3

2.4 各組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,而模型組和miR-27b NC組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、核固縮和溶解現(xiàn)象,排列分布不均且紊亂;與模型組相比,miR-27b拮抗劑組神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死現(xiàn)象改善,排列分布較為有序、均勻;與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組神經(jīng)細(xì)胞壞死、腫脹現(xiàn)象加重,排列分布雜亂無(wú)序(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 (HE,×400)Figure 1 Morphological changes of nerve cells in hippocampus of rats in each group (HE,×400)

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、邊界清晰、嵴未出現(xiàn)破損現(xiàn)象,而模型組和miR-27b NC組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體嵴和膜破損、邊界模糊,出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象;與模型組相比,miR-27b拮抗劑組線粒體腫脹及膜破損程度減輕、邊界較為清晰;與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組線粒體結(jié)構(gòu)破壞又見(jiàn)加重(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 (×30 000)Figure 2 Observation on the ultrastructure of mitochondria in hippocampal CA1 area of rats in each group (×30 000)

2.6 各組大鼠海馬區(qū)DRP1蛋白表達(dá)情況

DRP1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于神經(jīng)元樣細(xì)胞膜上,與對(duì)照組相比,模型組DRP1陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(P<0.05);與模型組相比,miR-27b NC組DRP1陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組DRP1陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組DRP1陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

圖3 大鼠海馬區(qū)DRP1蛋白表達(dá)情況 (×200)Figure 3 DRP1 protein expression in the hippocampus of rats (×200)

2.7 Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織中PINK1/parkin通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比,模型組海馬組織中PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,miR-27b NC組PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見(jiàn)表4、圖4)。

表4 大鼠海馬組織中PINK1/parkin通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況Table 4 Expression of PINK1/parkin pathway and autophagy related proteins in rat

圖4 Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織中PINK1/parkin通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 PINK1/parkin pathway and autophagy-related protein expression in rat hippocampus by Western blot

3 討論

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,影響中國(guó)約7%的人口,由大腦某特定區(qū)域神經(jīng)元異常引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制間不平衡所導(dǎo)致,其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今仍未研究清楚[5,10,11]。隨著癲癇發(fā)作時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)患者大腦神經(jīng)元所造成的損傷持續(xù)加重,嚴(yán)重影響患者心理和生理健康,因此尋找其有效治療方法十分重要[12]。

由于miRNA在癲癇的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用,因此有作為癲癇生物標(biāo)記物及治療靶標(biāo)的潛能[10]。有研究表明癲癇的發(fā)作機(jī)制與炎癥相關(guān),神經(jīng)炎癥可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病加重,miR-27b在多發(fā)性硬化癥、阿爾茲海默癥等幾種神經(jīng)炎性疾病中表達(dá)異常增加,研究發(fā)現(xiàn),抑制其表達(dá)則可緩解神經(jīng)炎癥[1,13]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-27b在癲癇大鼠腦組織中表達(dá)異常增加,抑制其表達(dá)可改善癲癇大鼠精神、飲食、皮毛狀態(tài),神經(jīng)細(xì)胞損傷程度,減少癲癇發(fā)作次數(shù),延長(zhǎng)發(fā)作潛伏期。上述結(jié)果表明miR-27b可能與癲癇的發(fā)生有關(guān),抑制其表達(dá)對(duì)疾病具有改善作用,其有作為癲癇治療靶點(diǎn)的潛能。

自噬是一個(gè)高度保守的細(xì)胞過(guò)程,為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),可將存在功能障礙的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分送至溶酶體進(jìn)行降解,該過(guò)程可在癲癇應(yīng)激下起保護(hù)作用,自噬功能障礙與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)[14,15]。PINK1/parkin作為經(jīng)典的自噬相關(guān)信號(hào)通路在線粒體運(yùn)動(dòng)和大小中具有重要作用[16]。PINK1是一種主要合成于細(xì)胞質(zhì)的蛋白激酶,在線粒體正常狀態(tài)下,其通過(guò)線粒體膜進(jìn)入線粒體內(nèi),經(jīng)線粒體蛋白酶PARL剪切后被蛋白酶體降解,而當(dāng)神經(jīng)元受損致使線粒體膜電位下降時(shí),PINK1被穩(wěn)定于線粒體外膜上募集parkin促進(jìn)自噬,清除受損細(xì)胞成分,從而保護(hù)細(xì)胞[6,16]。PINK1和parkin在神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)炎癥中具有重要作用,PINK1和parkin缺乏會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞中組織相容性復(fù)合物(MHC)觸發(fā)高水平的線粒體抗原,從而刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生[16,17]。研究發(fā)現(xiàn),parkin缺乏小鼠會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)元丟失及運(yùn)動(dòng)能力降低的現(xiàn)象[15]。miR-27b可通過(guò)靶向抑制PINK1表達(dá)來(lái)降低受損線粒體的自噬清除能力[7]。線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)作為線粒體分裂的重要蛋白,其表達(dá)異常增加會(huì)打破線粒體動(dòng)態(tài)平衡,致使線粒體功能損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-27b表達(dá)可改善癲癇大鼠大腦海馬組織線粒體損傷,降低DRP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),增加PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平,而PINK1上游因子PKA抑制劑H89可逆轉(zhuǎn)上述miR-27b抑制對(duì)癲癇大鼠損傷的改善作用。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[7],這表明miR-27b沉默對(duì)癲癇大鼠腦損傷的改善作用與PINK1/parkin通路有關(guān),miR-27b表達(dá)沉默可能通過(guò)促進(jìn)PINK1/parkin通路來(lái)促進(jìn)線粒體自噬,抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生,以此改善大鼠癲癇程度。

綜上所述,miR-27b表達(dá)沉默可通過(guò)促進(jìn)PINK1/parkin信號(hào)通路改善大鼠癲癇程度。本研究不僅為癲癇治療靶點(diǎn)的尋找提供參考,還對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制的研究具有重要意義。但在未來(lái)的研究中還需對(duì)其下游通路進(jìn)行深入研究。