多指標(biāo)-響應(yīng)曲面法優(yōu)選連翹葉中苷類有效部位的提取工藝

李思思,遆安航,譚麗媛,翟康欣,張淑蓉(山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,晉中 030600;通訊作者,E-mail:zhangsr62@163.com)

連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)為木犀科連翹屬落葉灌木植物,素有“瘡家圣藥”之稱,其主要功效有清熱解毒、疏肝行氣等[1]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明連翹具有抗菌、抗病毒、抗氧化及抗衰老等多種作用[2]。連翹中含有苯乙醇苷類(代表成分為連翹酯苷A)、木脂素類(代表成分為連翹苷)、黃酮類(代表成分為蘆丁)等多種苷類有效成分,連翹為臨床處方中常用藥物[2],廣泛應(yīng)用于清熱解毒的中藥制劑中。近年來由于“非典”“甲流”“新冠”等病毒感染性疾病泛濫,連翹的市場(chǎng)需求劇增,但其野生資源有限。連翹葉為木犀科連翹屬植物連翹的干燥葉,《本草綱目》中記載有“連翹莖葉,主治心肺積熱”等[3],在我國(guó)山西、陜西等地將連翹葉作為茶飲也有較長(zhǎng)歷史,連翹葉收載于《山西省中藥材中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》(2017年),同年列入《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)》[4,5]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)連翹葉中的化學(xué)成分與連翹果類似,且有些成分如蘆丁和連翹苷等含量遠(yuǎn)高于連翹果[1,6],也具有與連翹果相似的抗菌、保肝、抗氧化及抗衰老等作用[7-10],連翹葉資源合理利用成為熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷3種苷類有效成分為指標(biāo),采用響應(yīng)曲面法對(duì)連翹葉中苷類有效部位提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為提高連翹葉中苷類有效成分的利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(蘇州邦鑫電子技術(shù)有限公司);FA2104萬分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);AE240十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);H66MC超聲波清洗機(jī)(無錫超聲電子設(shè)備公司);HDM-500數(shù)顯電熱套(金壇杰瑞爾電器)。

1.2 藥物與試劑

連翹葉采自山西晉中(自然陰干,經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院裴香萍副教授鑒定為木犀科植物連翹的干燥葉);161079-160828連翹酯苷A(中國(guó)食品藥品檢定研究院);161153-160831蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院);111810-201907連翹苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院);20141021色譜級(jí)甲酸(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);20140110色譜級(jí)甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);20141101分析級(jí)無水乙醇(天津市北辰方正試劑廠);娃哈哈純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.3 色譜條件

BDS HYPERSIL C18(色譜柱250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-水(B),梯度洗脫,程序見表1;體積流量0.8 ml/min;柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm;進(jìn)樣量為10 μl。

表1 連翹葉的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of Forsythia leaves

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成含連翹酯苷B對(duì)照品1.52 mg/ml,連翹酯苷A對(duì)照品0.334 mg/ml和蘆丁對(duì)照品0.579 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取連翹葉30 g,碾碎后置于1 000 ml圓底燒瓶中,加入14倍量的40%乙醇,回流提取3次,合并濾液,放冷后,確定其體積。精密量取5 ml,置于10 ml量瓶中,用40%乙醇定容至刻度線,搖勻后,取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

1.5 測(cè)定法

精密吸取對(duì)照品、供試品各10 μl,使用“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.6 線性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品溶液精密稱取,置于20 ml容量瓶中,分別精密量取1,2,3,4,5 ml置于不同的10 ml容量瓶中,使用40%乙醇稀釋至刻度線,搖勻;分別進(jìn)樣,以各峰面積(S)為縱坐標(biāo),以對(duì)照品含量(C,μg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μl,照“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定,將對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取20190701批次汾河連翹葉6份,按供試品制備項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份,按照“1.3”項(xiàng)下色譜條件對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性考察。

1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“1.4.2”項(xiàng)下同一供試品溶液10 μl,分別于0,2,6,12,18,24 h進(jìn)樣測(cè)定。

1.10 加樣回收試驗(yàn)

精密量取“1.4.2”項(xiàng)下已知濃度的連翹葉提取液0.5 ml共6份,分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液,按“1.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定連翹葉提取液中各成分的平均回收率和計(jì)算RSD值。

1.11 單因素試驗(yàn)

以連翹酯苷A、蘆丁、連翹苷的綜合評(píng)分值Y(Y=連翹酯苷A含量/連翹酯苷A含量max×40%+蘆丁含量/蘆丁含量max×30%+連翹苷含量/連翹苷含量max×30%)為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)提取溶劑(水,20%乙醇,40%乙醇,60%乙醇,80%乙醇,100%乙醇)、提取時(shí)間(30,60,90,120,150,180 min)、溶劑加入量(8,10,12,14,16,18倍量)進(jìn)行考察(n=3)。

1.12 Box-Behnken響應(yīng)曲面法

以提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)為影響因素,“1.11”項(xiàng)下綜合評(píng)分值(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)三因素三水平17組試驗(yàn)。

1.13 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)曲面響應(yīng)得到最優(yōu)提取工藝條件為檢測(cè)此方法是否穩(wěn)定可靠,精密稱取3份20190701批次汾河連翹葉按照最優(yōu)的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定法試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照品及連翹葉樣品的HPLC色譜圖結(jié)果顯示各峰峰型對(duì)稱,分離度良好(見圖1),可用于數(shù)據(jù)分析。

1.連翹酯苷A;2.蘆丁;3.連翹苷?qǐng)D1 對(duì)照品及連翹葉樣品的HPLC色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatograms of reference substance and forsythia leaf sample

2.2 線性關(guān)系結(jié)果

連翹酯苷A回歸方程為Y=5 978.5X+22 074,r=0.999 6;蘆丁Y=15 611X+97 581,r=0.999 9;連翹苷Y=5 540X+1 161.7,r=0.999 8;分別在0.053 2-0.532 mg/ml,0.081 6-0.645 mg/ml,0.205 4-0.818 mg/ml之間呈良好線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷精密度的RSD值分別為0.85%,0.73%,0.94%,均小于3%。結(jié)果表明儀器有良好的精密度。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)得連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷的重復(fù)性試驗(yàn)RSD值分別為1.77%,1.47%,2.39%,均小于3%。說明該方法有良好的重復(fù)性。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值分別為2.30%,2.29%,2.33%,均小于3%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

連翹葉提取液中連翹酯苷A、蘆丁、連翹苷的平均回收率分別為100.8%,99.7%,100.0%,RSD值分別為1.08%,0.61%,0.89%。說明該方法有良好的準(zhǔn)確度。

2.7 單因素試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素考察結(jié)果選擇40%乙醇為提取溶媒;Box-Behnken響應(yīng)曲面分析時(shí),提取時(shí)間選擇90,120,150 min;在溶劑加入量選擇中,綜合考慮成本問題,選用12倍、14倍、16倍溶劑加入量作為考察指標(biāo);提取次數(shù)一般不超過3次,所以選用1次、2次、3次為考察指標(biāo)(見圖2)。

圖2 連翹葉提取工藝單因素考察結(jié)果Figure 2 Single factor results of extraction process investigation

2.8 Box-Behnken響應(yīng)曲面結(jié)果

因素水平見表2,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3,方差分析見表4。由表4可知,因素B具有顯著影響(P<0.01),因素B2具有較顯著影響(0.01

表2 連翹葉提取工藝響應(yīng)曲面因素水平Table 2 Response surface factor levels for Forsythia suspensa leaf extraction process

表3 連翹葉提取工藝響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface for Forsythia leaf extraction process

表4 連翹葉提取工藝響應(yīng)曲面方差分析Table 4 Variance analysis of response surface for Forsythia leaf extraction process

通過Design Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)曲面分析,結(jié)果見圖3。當(dāng)料液比固定不變時(shí),固定提取次數(shù)不變,隨著提取時(shí)間變長(zhǎng),響應(yīng)值緩慢降低;提取時(shí)間不變,隨著提取次數(shù)增多,響應(yīng)值增大(見圖3A)。固定提取次數(shù)不變時(shí),固定溶劑加入量不變,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),響應(yīng)值有所降低;而固定提取時(shí)間不變時(shí),隨著溶劑加入量增大,響應(yīng)值先增高后降低,但趨勢(shì)并不明顯(見圖3B)。固定提取時(shí)間不變時(shí),溶劑加入量不變,隨著提取次數(shù)增多,響應(yīng)值升高;提取次數(shù)不變,隨著溶劑加入量增大,響應(yīng)值逐漸升高,但趨勢(shì)并不明顯(見圖3C)。軟件所得最佳提取工藝為提取時(shí)間1.5 h,提取3次,溶劑加入量為14倍時(shí)為最優(yōu)工藝。

圖3 連翹葉提取工藝各因素曲面響應(yīng)圖Figure 3 Curve response results of various factors in the extraction process of Forsythia suspensa leaves

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)曲面響應(yīng)結(jié)果選取最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),精密稱取連翹葉30 g,碾碎后置于1 000 ml圓底燒瓶中,加入14倍量的40%乙醇,回流提取3次,每次1.5 h,合并濾液,放冷后,確定其體積。精密量取5 ml,置于10 ml量瓶中,用40%乙醇定容至刻度線,搖勻后,取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜,通過HPLC對(duì)連翹葉中連翹酯苷A、蘆丁與連翹苷的含量進(jìn)行檢測(cè),對(duì)提取工藝結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)平行操作3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。最終確定提取工藝為提取時(shí)間1.5 h,提取次數(shù)3 次,料液比1 ∶14,此時(shí),連翹葉中連翹酯苷A含量為7.73%,蘆丁含量為1.07%,連翹苷含量為1.13%,綜合評(píng)分值Y為98.06%。

表5 連翹葉最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Contents of active ingredients in Forsythia suspensa leaves based on optimal extraction technology

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明連翹葉和連翹一樣,均具有抗菌、保肝、抗氧化、抗衰老等作用。在《山西省中藥材中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》亦有記述連翹葉具有清熱解毒等功效[7-9]。但現(xiàn)階段對(duì)連翹葉開發(fā)程度不深,并未記載藥用,僅局限于連翹葉茶。連翹葉中的連翹酯苷A、連翹苷具有明確的抗菌、解熱、抗氧化等藥理作用,蘆丁具有抗炎等功效,針對(duì)這些成分苷類結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn),故實(shí)驗(yàn)選用連翹酯苷A、蘆丁、連翹苷為指標(biāo)對(duì)連翹葉中苷類有效部位進(jìn)行提取工藝研究,又因連翹酯苷A含量高且抗氧化等功效強(qiáng)于蘆丁與連翹苷[10,11]。綜合考慮,在單因素試驗(yàn)綜合評(píng)分值Y中連翹酯苷A占40%,蘆丁與連翹苷各占30%。

本研究采用單因素試驗(yàn),分別考察了提取溶媒、提取時(shí)間、溶劑加入量對(duì)綜合評(píng)分值Y的影響。在此基礎(chǔ)上,通過Design Expert軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn),并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果顯示當(dāng)提取溶媒為40%乙醇,提取3次,每次1.5 h,溶媒加入量為14倍量時(shí)綜合評(píng)分值最高,此時(shí)連翹酯苷A含量為7.73%,蘆丁含量為1.07%,連翹苷含量為1.13%。因此利用響應(yīng)面分析方法對(duì)連翹葉中苷類成分提取工藝進(jìn)行優(yōu)化合理可行,該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,易于操作,專屬性強(qiáng),可為后續(xù)將連翹葉開發(fā)成藥品、保健品或功能食品等提供理論依據(jù)。