積雪草酸對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后IL-33/ST2信號通路及小膠質(zhì)細胞的影響

胡 煒,劉建敏,金海濤,呂建萌,王 沛,王 剛,黨星波(陜西省人民醫(yī)院急診外科,西安 710000;通訊作者,E-mail:dangxb2006@163.com)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一種嚴重的腦血管疾病,可誘發(fā)長期的神經(jīng)功能缺損,死亡率和致殘率極高[1]。在SAH后的急性期,活化的小膠質(zhì)細胞可引起促炎細胞因子的急性上調(diào)及自由基的產(chǎn)生,繼而加重腦水腫和繼發(fā)性神經(jīng)元損傷甚至凋亡[2,3]。積雪草酸是從積雪草中分離得到的三萜類物質(zhì),具有顯著的抗氧化和抗炎作用[4,5]。研究證實,積雪草酸具有強大的神經(jīng)保護特性,可緩解局灶性腦中風(fēng)[6]和阿爾茨海默病[5]模型中出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)元損傷。然而,積雪草酸能否緩解SAH后早期腦損傷及其具體作用機制尚不清楚。

ST2是一種IL-1受體家族的受體蛋白,主要在各種免疫細胞上表達[7]。ST2可與其配體白細胞介素-33(IL-33)的受體,在免疫細胞反應(yīng)介導(dǎo)的保護性免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用[8]。近期研究發(fā)現(xiàn),IL-33/ST2信號通路的激活可通過抑制小膠質(zhì)細胞激活減輕局灶性腦中風(fēng)后的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷[9]。因此,本研究擬探討積雪草酸治療對大鼠SAH后IL-33/ST2信號通路及早期腦損傷影響,為治療SAH的研究提供新的方向和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設(shè)備

積雪草酸購自美國Sigma公司;ED-1(CD68)、IL-33和ST2抗體購自美國Abcam公司;β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;TUNEL凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自美國Sigma公司;Alexa Fluor 488標記熒光二抗購自美國Life technologies公司。

1.2 實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血(eSAH)模型制備

參照文獻[10]采用血管內(nèi)穿刺法建立大鼠實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血(eSAH)模型。氯胺酮(100 mg/kg)麻醉大鼠后,分離右頸總動脈、右頸外動脈和右頸內(nèi)動脈。在右頸外動脈遠側(cè)作一切口,將4-0單絲尼龍縫合線經(jīng)殘端置入,引入頸內(nèi)動脈直至感覺到阻力,此時距頸總動脈分叉處約20 mm。繼續(xù)將縫合線推進約3 mm,穿透大腦中動脈分叉處的頸內(nèi)動脈,后立即撤回縫合線,允許頸內(nèi)動脈再灌注以制成eSAH模型。

1.3 實驗分組

體質(zhì)量280-330 g雄性SD大鼠,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。隨機分為4組:假手術(shù)組(sham組)、實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血組(eSAH組)、積雪草酸低劑量組(積雪草酸低劑量組)和積雪草酸高劑量組(積雪草酸高劑量組),每組18只。sham組僅在手術(shù)操作中將尼龍線頭端送至右頸內(nèi)動脈,但不刺破動脈管壁;eSAH組、積雪草酸低劑量組和積雪草酸高劑量組制備eSAH模型。積雪草酸低劑量組和積雪草酸高劑量組分別于模型制備后0,6,12 h腹腔注射50 mg/kg和75 mg/kg積雪草酸(溶于1 ml生理鹽水)[6];sham組和eSAH組于術(shù)后或模型制備后0,6,12 h腹腔注射1 ml生理鹽水。

1.4 腦水含量測定

每組取6只大鼠,于eSAH后24 h用過量注射戊巴比妥鈉(150 mg/kg)麻醉大鼠,取出腦組織并快速分離成左半球、右半球、小腦和腦干。立即稱量腦標本得濕重,于100 ℃烘箱中干燥48 h,稱得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 Western blot檢測IL-33和ST2蛋白表達

每組取6只大鼠,于eSAH后24 h過量注射戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死大鼠。取右腦半球皮質(zhì),稱重后充分勻漿并離心。BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)含量后,將等量蛋白質(zhì)重懸于上樣緩沖液中。100 ℃下變性10 min后,用120 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳分離并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后,與相應(yīng)一抗(IL-33抗體,1 ∶1 000;ST2抗體,1 ∶1 000;β-actin抗體,1 ∶500)反應(yīng)12 h。之后加入抗兔/小鼠IgG辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶5 000)處理膜,用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影并通過X線膠片顯現(xiàn)。使用Image J軟件分析量化條帶密度。

1.6 TUNEL凋亡及ED-1陽性小膠質(zhì)細胞檢測

每組取6只大鼠,于eSAH后24 h,麻醉大鼠并用40 g/L多聚甲醛經(jīng)心臟灌注2 h。分離腦組織,在40 g/L多聚甲醛中后固定6 h,石蠟包埋后切成約5 μm厚的切片。用10 g/L Triton X-100透化2 min,封閉30 min后,根據(jù)廠商的說明書使用行TUNEL染色,并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)行核復(fù)染。熒光顯微鏡400倍鏡下觀察損傷測大腦皮層并攝片,DAPI染色細胞核呈藍色熒光,TUNEL陽性細胞核呈紅色熒光,計算凋亡指數(shù)(=TUNEL陽性凋亡細胞數(shù)/DAPI有核細胞總數(shù)×100%)。

將切片在4 ℃下與ED-1一抗(1 ∶200)孵育24 h。第2天,用PBS洗滌切片,室溫下加入Alexa Fluor 488標記的熒光二抗孵育2 h。熒光顯微鏡400倍鏡下觀察并攝片,計數(shù)5個不同視野中ED-1陽性細胞,計算ED-1陽性細胞密度(個/mm2)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SAH后大鼠腦大體標本觀察情況

大體標本觀察發(fā)現(xiàn),eSAH組大鼠腦標本多處因血液進入蛛網(wǎng)膜下腔而呈紅色,以willis環(huán)附近最為明顯,而sham組則未見明顯出血表現(xiàn),腦組織表面發(fā)白(見圖1),說明eSAH模型構(gòu)建成功。

A.假手術(shù)組 B.實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血組圖1 SAH后大鼠腦大體標本觀察情況Figure 1 General observation of brain tissues in sham group and eSAH group

2.2 各組大鼠SAH后腦水含量的比較

與sham組比較,eSAH組大鼠左大腦半球、右大腦半球及小腦的含水量顯著增加(P<0.05);與eSAH組比較,積雪草酸低劑量組和積雪草酸高劑量組左大腦半球和右大腦半球含水量明顯減少(P<0.05),而小腦含水量未見明顯改變(P>0.05);與積雪草酸低劑量組比較,積雪草酸高劑量組腦含水量未見明顯差異(P>0.05,見圖2)。

與sham組比較,*P<0.05;與eSAH組比較,#P<0.05圖2 各組大鼠SAH后腦水含量的比較Figure 2 Comparison of the water content after subarachnoid hemorrhage among the groups

2.3 各組大鼠SAH后大腦皮層IL-33和ST2蛋白表達水平的比較

與sham組比較,eSAH組大腦皮層IL-33和ST2蛋白表達有所增加(P<0.05);與eSAH組比較,積雪草酸低劑量組和積雪草酸高劑量組大腦皮層IL-33和ST2蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05);與積雪草酸低劑量組比較,積雪草酸高劑量組大腦皮層IL-33和ST2蛋白表達顯著增加(P<0.05,見圖3)。

與sham組比較,*P<0.05;與eSAH組比較,#P<0.05;與積雪草酸低劑量組組比較,&P<0.05圖3 各組大鼠SAH后大腦皮層IL-33和ST2蛋白表達水平的比較Figure 3 Comparison of cerebral IL-33 and ST2 protein expression after subarachnoid hemorrhage among the groups

2.4 各組大鼠SAH后大腦皮層ED-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)的比較

與sham組比較,eSAH組大腦皮層ED-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)明顯增加(P<0.05);與eSAH組比較,積雪草酸低劑量組和積雪草酸高劑量組大腦皮層ED-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)顯著減少(P<0.05);與積雪草酸低劑量組比較,積雪草酸高劑量組大腦皮層ED-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)未見明顯差異(P>0.05,見圖4)。

ED-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)呈綠色熒光圖4 各組大鼠SAH后大腦皮層ED-1陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)的比較Figure 4 Comparison of the number of ED-1-positive microglia after subarachnoid hemorrhage among the groups

2.5 各組大鼠SAH后腦皮層凋亡指數(shù)的比較

與sham組比較,eSAH組大腦皮層凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.05);與eSAH組比較,積雪草酸低劑量組和積雪草酸高劑量組大腦皮層凋亡指數(shù)顯著減少(P<0.05);與積雪草酸低劑量組比較,積雪草酸高劑量組大腦皮層凋亡指數(shù)未見明顯差異(P>0.05,見圖5)。

TUNEL陽性凋亡細胞呈紅色熒光,細胞核用DAPI復(fù)染呈藍色熒光圖5 各組大鼠SAH后腦皮層凋亡指數(shù)的比較Figure 5 Comparison of the apoptotic index after subarachnoid hemorrhage among the groups

3 討論

本研究探討了積雪草酸對蛛網(wǎng)膜下腔出血后IL-33/ST2信號通路及小膠質(zhì)細胞的影響。研究結(jié)果顯示,腹腔注射50 mg/kg或75 mg/kg的積雪草酸均能減輕大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦水腫,激活I(lǐng)L-33/ST2信號通路,并抑制小膠質(zhì)細胞的活化。

積雪草酸已被證實在局灶性腦缺血[6]、阿爾茨海默病[5]、帕金森綜合征[11]等多種動物模型中具有腦保護作用。與之一致,本研究結(jié)果表明,積雪草酸治療可有效緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后出現(xiàn)的腦水腫和細胞凋亡。積雪草酸的這種作用對蛛網(wǎng)膜下腔出血具有實用的臨床意義。首先,蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣和血腦屏障破壞是導(dǎo)致腦水腫和患者死亡的關(guān)鍵機制,而已有研究證實積雪草酸可維持血腦屏障的完整性,對蛛網(wǎng)膜下腔出血后病理改變具有較好的針對性;其次,即使在局灶性腦缺血發(fā)作后12 h給藥,積雪草酸治療也具有神經(jīng)保護作用,這就說明其在臨床上具有更長的治療時間窗;最后,積雪草酸雖然半衰期僅有2 h,但治療的效果卻可以持續(xù)到14 d,這表明積雪草酸具有較好的持續(xù)獲益[6]。

小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)的先天性免疫細胞[12]。在SAH后,小膠質(zhì)細胞可顯著增殖活化,并產(chǎn)生大量促炎細胞因子(如IL-6和TNF-α)[12]。在小鼠和人類樣品中發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細胞可在血管出血部位開始積聚,逐漸向周圍皮質(zhì)擴散,并在出血后第7-14天達到最大[12]。該變化趨勢與SAH患者的死亡和腦血管痙攣發(fā)生的高峰期基本吻合。本研究通過檢測ED-1(小膠質(zhì)細胞活化標志物[13])陽性細胞的密度以反映小膠質(zhì)細胞的活化程度,結(jié)果顯示SAH后24 h受損皮層中活化小膠質(zhì)細胞顯著增多。已有體外研究發(fā)現(xiàn),積雪草酸可抑制BV2小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[14]。而本研究首次在體內(nèi)研究中證實,腹腔注射積雪草酸可顯著減輕SAH后小膠質(zhì)細胞的活化。這就說明,積雪草酸可能通過抑制小膠質(zhì)細胞活化緩解SAH后出現(xiàn)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)損傷。

IL-33/ST2信號通路在管理腦缺血損傷后小膠質(zhì)細胞的活化和功能中起到關(guān)鍵作用[15]。ST2基因缺陷可加劇急性腦缺血再灌注損傷后腦梗死面積和神經(jīng)功能損傷[9]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SAH后受損皮質(zhì)中IL-33和ST2的蛋白表達均有所增加。鑒于ST2主要表達于小膠質(zhì)細胞[9],我們推測SAH后IL-33/ST2信號通路的初步激活可能與小膠質(zhì)細胞的增殖相關(guān)。而本研究進一步結(jié)果發(fā)現(xiàn),積雪草酸可顯著上調(diào)受損皮質(zhì)中IL-33和ST2的蛋白表達。已有研究發(fā)現(xiàn),激活I(lǐng)L-33/ST2信號通路可促使小膠質(zhì)細胞由炎癥性的M1型向抗炎性的M2型小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變[9]。因此我們推測,積雪草酸可能通過激活I(lǐng)L-33/ST2信號通路抑制SAH后小膠質(zhì)細胞激活,進而緩解炎癥反應(yīng)和細胞凋亡,最終起到神經(jīng)保護的作用。

綜上所述,積雪草酸治療可減輕大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后小膠質(zhì)細胞激活及細胞凋亡,其作用機制可能與激活I(lǐng)L-33/ST2信號通路相關(guān)。