煙酰胺核糖抵抗高脂飲食誘導(dǎo)心肌損傷的機(jī)制研究

郭艷杰,文 和,衛(wèi)錦娟,王 瑩,倪四峰,馬 煒,王長鷹,陳 寧(西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心內(nèi)科,西安 70075;空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系;空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科;西北農(nóng)林科技大學(xué)醫(yī)院;通訊作者,E-mail:0605@qq.com)

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)報(bào)道,預(yù)計(jì)到2040年,全球肥胖人數(shù)將超過5億,2型糖尿病患者人數(shù)將超過6.42億[1]。肥胖與2型糖尿病常常前后發(fā)生,并伴隨有高脂血癥和胰島素敏感性降低[2]。諸多研究[3,4]表明,肥胖、2型糖尿病的出現(xiàn)將嚴(yán)重危害心血管健康,二者會導(dǎo)致心臟出現(xiàn)代謝紊亂、脂質(zhì)堆積、氧化應(yīng)激損傷加劇等諸多不良改變,最終損害心臟功能,嚴(yán)重時將導(dǎo)致心衰的發(fā)生。來自歐洲的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,超過80%的心衰患者為肥胖人群[5]。

脂肪酸是心臟能量供給的重要來源,正常心肌組織70%-90%的能量來自脂肪酸的β氧化。由于肥胖人群常常存在高脂血癥并伴隨胰島素敏感性降低,心肌組織對糖的利用率進(jìn)一步降低,對脂肪酸的吸收利用進(jìn)一步增加[6]。同時,肥胖患者常常存在心肌線粒體功能損傷,導(dǎo)致大量脂肪酸無法在心肌組織中被完全氧化利用[7]。大量的脂肪酸及其中間代謝產(chǎn)物(二酰基甘油、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺等)在心肌組織堆積,干擾心肌組織生物信號的正常傳遞,過量蓄積的過氧化脂質(zhì)還將極大加重心肌組織的氧化應(yīng)激損傷[8]。因此,有效地促進(jìn)心肌組織脂質(zhì)的完全代謝,減少脂質(zhì)及其中間代謝產(chǎn)物的堆積,是抵抗肥胖誘導(dǎo)的心肌損傷的重要途徑。

煙酰胺核糖(nicotinamide riboside, NR)是一類存在于牛奶中的小分子物質(zhì),屬B族維生素衍生物。既往研究表明,煙酰胺核糖具有抗氧化、抗衰老、心血管保護(hù)等治療效果[9]。發(fā)表在CellMetabolism的一項(xiàng)研究意外發(fā)現(xiàn),NR能夠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖[10],提示NR可能與脂質(zhì)代謝存在密切聯(lián)系,但是該研究未對NR是否能夠促進(jìn)心肌脂代謝及其具體機(jī)制作深入探討,本研究通過建立肥胖動物模型及高脂細(xì)胞模型,并給予外源性NR干預(yù),觀察NR對于心臟功能、心肌組織脂質(zhì)代謝的影響,并探尋其具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級野生型C57BL小鼠24只,鼠齡8周齡,體質(zhì)量20-25 g,購自常州卡文斯模式動物中心。

1.1.2 試劑 高脂飼料購自美國Research Diet公司;煙酰胺核糖購自美國Sigma公司;神經(jīng)酰胺含量測試盒購自碧云天生物公司;游離脂肪酸含量測試盒購自美國默克公司;過氧化脂質(zhì)含量測試盒購自美國默克公司;線粒體綠色熒光探針購自美國Thermo公司;脂肪酸紅色熒光探針購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型的建立 24只8周齡雄性小鼠隨機(jī)分為3組:正常飲食組(Con組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+煙酰胺核糖組(HFD+NR組),每組8只。高脂飲食組給予高脂飲食喂養(yǎng)4個月以誘導(dǎo)肥胖小鼠模型。高脂飲食+煙酰胺核糖組給予高脂喂養(yǎng)4個月,在高脂喂養(yǎng)的第3月初開始同時給予800 mg/kg的NR溶于生理鹽水中灌胃,持續(xù)灌胃2個月。

1.2.2 超聲心動圖檢測小鼠心臟功能 使用高分辨率超聲儀檢測小鼠心臟功能;以異氟烷麻醉小鼠,將小鼠固定在恒溫墊上。獲取胸骨旁長軸切面的M型超聲心動圖,軟件自動測算左心室射血分?jǐn)?shù)以及左心室短軸縮短率。

1.2.3 心肌組織油紅O染色 將取下的心臟標(biāo)本置于4%的多聚甲醛溶液中,冰凍條件下切片。按照油紅O染色試劑盒(西安中暉赫彩生物)說明書制備油紅O染色工作液并進(jìn)行染色,染色完成后光鏡下觀察并拍照。

1.2.4 原代心肌細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 選擇1-3日齡的SD大鼠乳鼠,放入75%酒精溶液充分浸泡消毒,取出心臟,放置于PBS中充分清洗,剪碎,加入Ⅰ型膠原酶消化30 min,取消化液離心重懸鋪板。將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)組(Con組),高脂培養(yǎng)組(Pal組)和高脂培養(yǎng)+煙酰胺核糖組(Pal+NR組)。Con組給予含25 mmol/L葡萄糖+10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Pal組在Con組基礎(chǔ)上同時給予500 μmol/L的棕櫚酸培養(yǎng)24 h;Pal+NR組在Pal組基礎(chǔ)上同時加入2 mmol/L的煙酰胺核糖培養(yǎng)24 h。

1.2.5 心肌組織神經(jīng)酰胺、游離脂肪酸、二?；视秃康臋z測 取新鮮心肌組織,充分研磨,離心后取上清。使用美國BD公司的神經(jīng)酰胺含量測試盒、游離脂肪酸含量測試盒和二?；视秃繖z測試劑盒,所有操作均按照試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行,規(guī)范操作后上機(jī),酶標(biāo)儀分析獲得數(shù)據(jù)。

1.2.6 Seahorse檢測心肌細(xì)胞脂肪酸β-氧化效率 提前將原代心肌細(xì)胞種植于特制的細(xì)胞培養(yǎng)板中(V7-PS,安捷倫公司),并給予高脂或NR處理24 h。檢測當(dāng)天,將培養(yǎng)基更換為Seahorse檢測液,置入37 ℃孵箱穩(wěn)定1 h。依次加入寡霉素、FCCP和抗霉素,由Seahorse檢測儀通過檢測探頭分別檢測細(xì)胞基礎(chǔ)氧耗值,ATP生成相關(guān)的氧耗值和最大氧耗值。依托莫西(Etomoxir)為脂肪酸β氧化的抑制劑,對照組加入依托莫西后降低的差值即為脂肪酸依賴的線粒體氧耗率。

1.2.7 線粒體、脂肪酸的染色 按照說明書操作步驟制備線粒體探針染色工作液(Mito-tracker green, thermo公司),直接向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2 μl/ml的線粒體染色工作液進(jìn)行染色,放入孵箱中避光孵育30 min,即可在共聚焦顯微鏡下觀察拍照。脂肪酸染色需提前16 h向培養(yǎng)基中加入0.2 μl/ml的Bodipy 558/568 C12工作液(thermo公司,美國),培養(yǎng)16 h后即可在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 煙酰胺核糖對高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠心臟功能的影響

相比于正常喂養(yǎng)小鼠,高脂飲食喂養(yǎng)小鼠4個月后,小鼠心臟功能出現(xiàn)顯著損傷,表現(xiàn)在高脂飲食組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)顯著低于正常飲食組(P<0.05);左心室短軸縮短率顯著低于正常飲食組(P<0.05)。相比于單純高脂飲食組,煙酰胺核糖治療組的小鼠心臟功能出現(xiàn)了顯著的改善,左心室射血分?jǐn)?shù)顯著升高(P<0.05)左心室短軸縮短率顯著升高(P<0.05,見圖1)。

2.2 煙酰胺核糖對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠體質(zhì)量及心臟脂質(zhì)含量的影響

相比于正常喂養(yǎng)組,高脂飲食組喂養(yǎng)小鼠4個月后,小鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05);相比于單純高脂飲食組,煙酰胺核糖治療組小鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.05)。油紅O染色顯示,相比于正常飲食組,高脂飲食組小鼠心肌組織出現(xiàn)了大量脂質(zhì)堆積(見圖2,左上脂質(zhì)染色呈現(xiàn)棕紅色點(diǎn)狀,棕紅色深者脂質(zhì)堆積更加顯著)。此外,相比于正常飲食組,高脂飲食組小鼠心肌組織的神經(jīng)酰胺含量、游離脂肪酸含量以及過氧化脂質(zhì)含量也顯著增多(P<0.05)。相比于單純高脂組,煙酰胺核糖治療組小鼠心肌組織的脂滴含量、神經(jīng)酰胺含量、游離脂肪酸含量以及過氧化脂質(zhì)含量都出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)。

2.3 煙酰胺核糖對原代心肌細(xì)胞脂肪酸氧化效率的影響

Seahorse檢測脂肪酸-線粒體熒光共染結(jié)果顯示,相比于高脂處理組,煙酰胺核糖+高脂處理組脂代謝相關(guān)的基礎(chǔ)氧耗率和最大氧耗率均出現(xiàn)了顯著升高(P<0.05,見圖3),表明煙酰胺核糖能夠顯著增加原代心肌細(xì)胞的脂肪酸氧化代謝效率。

2.4 煙酰胺核糖對原代心肌細(xì)胞脂肪酸分布的影響

線粒體脂肪酸共染結(jié)果顯示,正常培養(yǎng)組原代心肌細(xì)胞中,脂肪酸與線粒體能夠基本重合(92.1%±3.3%),表明絕大部分脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β-氧化。高脂處理細(xì)胞后,大部分脂肪酸聚集于細(xì)胞其他部分,未進(jìn)入線粒體氧化,脂肪酸與線粒體的重合率出現(xiàn)了顯著下降(34.2%±4.2%)。在給予外源性NR后,脂肪酸重新進(jìn)入線粒體,脂肪酸與線粒體的重合率出現(xiàn)了顯著改善(58.4%±8.1%),表明煙酰胺核糖可能通過促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體β-氧化加速脂肪酸氧化效率,從而改善心肌組織脂質(zhì)堆積。

3 討論

發(fā)表在柳葉刀雜志的最新研究結(jié)果表明,中國成年人中已經(jīng)有超過一半的人群存在超重或肥胖[11]。肥胖、高脂血癥和脂代謝異常與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。脂質(zhì)是心肌組織的主要能量來源,正常情況下,心肌組織大約70%-90%的能量供給依賴于脂肪酸的β-氧化。由于肥胖患者往往伴發(fā)胰島素抵抗癥狀,導(dǎo)致心肌組織對糖的利用進(jìn)一步減少,對脂肪酸的依賴程度進(jìn)一步增加。線粒體是心肌細(xì)胞的能量功能,也是脂肪酸進(jìn)行β-氧化的唯一場所。大量研究指出,肥胖、2型糖尿病患者心肌組織往往存在大量的脂質(zhì)堆積,表現(xiàn)為脂滴增多和游離脂肪酸含量增多[12,13],本研究也證實(shí)了在高脂喂養(yǎng)小鼠心肌組織中,心肌組織的脂滴、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺以及過氧化脂質(zhì)顯著增多。神經(jīng)酰胺是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子,在細(xì)胞內(nèi)承擔(dān)第二信使的重要角色,心肌組織神經(jīng)酰胺的異常增多將嚴(yán)重?cái)_亂心肌細(xì)胞中正常的生物信號傳遞,危害心肌細(xì)胞功能[14]。過氧化脂質(zhì)是脂肪酸被氧化后的產(chǎn)物,是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物和重要來源,心肌細(xì)胞中過氧化脂質(zhì)的增多將大大加重心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,造成細(xì)胞凋亡,最終造成心臟功能損傷。本研究結(jié)果也證實(shí),高脂飲食能夠直接誘導(dǎo)心臟功能損傷。如何有效地將脂肪酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體使之完全氧化分解為無害的終末產(chǎn)物,是解決心肌組織脂毒性的重要途徑。

圖4 煙酰胺核糖對原代心肌細(xì)胞脂肪酸分布的影響 (n=6-8)Figure 4 Effect of NR on fatty acid distribution in cardiomyocytes (n=6-8)

既往研究[10]提示,煙酰胺核糖可能與脂肪酸代謝存在一定的關(guān)聯(lián),即煙酰胺核糖可能有一定的減肥效果。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明,對于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖,外源性給予煙酰胺核糖具有顯著抑制體質(zhì)量增加的效果,但其具體內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。具體到心肌組織,本研究表明,外源性煙酰胺核糖能夠顯著減少心肌組織中的脂質(zhì)及其中間代謝產(chǎn)物的堆積。心臟超聲功能檢測進(jìn)一步證實(shí)了外源性煙酰胺核糖對于心臟功能的保護(hù)作用。正常情況下,細(xì)胞中的脂質(zhì)大部分進(jìn)入線粒體中進(jìn)行氧化分解。然而2019年發(fā)表在DevelopmentalCell雜志的研究表明,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部無法消耗過多的脂質(zhì)時,細(xì)胞會通過出泡的方式將多余的脂質(zhì)排出細(xì)胞[15]。為了明確煙酰胺核糖是通過促進(jìn)脂質(zhì)的氧化還是促進(jìn)脂質(zhì)的排出,我們首先對線粒體的脂肪酸代謝效率進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,煙酰胺核糖能夠顯著提高線粒體的脂肪酸代謝效率。進(jìn)一步用兩種不同探針的檢測結(jié)果表明,煙酰胺核糖能夠直接促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體,為脂肪酸的完全氧化創(chuàng)造條件。煙酰胺核糖已經(jīng)不止一次出現(xiàn)在人們的視野中。既往認(rèn)為,煙酰胺核糖在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為NAD+,并進(jìn)一步以SIRT家族依賴性的方式發(fā)揮作用[16,17]。本研究首次在動物和細(xì)胞層面指出,煙酰胺核糖能夠顯著改善高脂誘導(dǎo)的心肌損傷,并進(jìn)一步指出煙酰胺核糖能夠直接促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸的β-氧化,從而抵抗高脂喂養(yǎng)引起的心臟脂質(zhì)堆積。煙酰胺核糖這一作用的具體機(jī)制尚未完全闡釋,針對此問題本課題正在作進(jìn)一步深入研究。

綜上,本研究首次證實(shí),外源性給予NR能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化代謝,從而減少高脂誘導(dǎo)的心肌組織脂質(zhì)堆積,最終抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的心臟功能損傷。本研究對于臨床肥胖患者心臟功能損傷的藥物治療具有一定的啟發(fā)意義。