miR-186-5p調(diào)控NEK2表達(dá)對(duì)HL-60細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響

周蘭蘭,李銘杰,關(guān)則兵,朱秋花,劉亞楠,曾文彬,邱石球,高延民,王 宏(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科,廣州 510080)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是造血系統(tǒng)的髓系原始細(xì)胞克隆性惡性增殖性疾病,常有發(fā)熱、出血、貧血等臨床表現(xiàn),預(yù)后效果較差、生存率較低[1,2]。AML治療主要以化療為主,阿霉素(adriamycin,ADR)是重要化療藥物之一,可抑制DNA、RNA的合成,抗瘤譜較廣,對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用,適用于急性白血病、粒細(xì)胞白血病等疾病的化療,對(duì)急性髓系白血病HL-60細(xì)胞具有一定的殺傷作用[3,4],化療過(guò)程中白血病細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性,導(dǎo)致化療藥物的化療作用明顯降低[5],因此探究白血病細(xì)胞耐藥性的可能機(jī)制對(duì)于臨床治療AML具有重要意義。miRNA是廣泛存在于人體的非編碼小分子RNA,參與細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程,多項(xiàng)研究表明miRNA與白血病細(xì)胞的耐藥性聯(lián)系密切[6,7],miR-186是miRNA家族成員之一,在人AML患者血清中呈現(xiàn)低表達(dá),朱娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-186表達(dá)可降低人AML細(xì)胞對(duì)ADR的耐藥性。miR-186-5p是由miR-186前體形成的miRNA成熟體,但關(guān)于miR-186-5p對(duì)AML細(xì)胞ADR耐藥性的影響機(jī)制報(bào)道較少[9]。中心體相關(guān)激酶2(centrosome-associated kinase 2,NEK2)具有調(diào)控紡錘體、染色體、中心體等功能,在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用,與HL-60細(xì)胞的增殖及凋亡過(guò)程聯(lián)系密切[10],本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-186-5p與NEK2存在結(jié)合位點(diǎn),但miR-186-5p能否通過(guò)調(diào)控NEK2來(lái)影響AML細(xì)胞ADR耐藥性尚不可知。因此本文通過(guò)構(gòu)建HL-60 ADR耐藥細(xì)胞,探究miR-186-5p對(duì)HL-60細(xì)胞的ADR耐藥性及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人急性髓系白血病細(xì)胞HL-60(貨號(hào):BFN608006116)購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑及儀器

ADR(貨號(hào):A24360)購(gòu)于上海吉至生化科技有限公司;miR-186-5p模擬物(mimic)、NEK2 mimic及相關(guān)陰性對(duì)照均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號(hào):164210、PM150110A)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;LipofectamineTM2000 Reagent(貨號(hào):11668-027)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;RNA提取試劑盒、一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):R1200、T2240、BC3711、PC0020)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;兔源NEK2、GAPDH、抗P-蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、抗谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π(glutathione S-transferase π,GST-π)一抗、羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):ab247817、ab9485、ab262880、ab138491、ab133470)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào):Forma 370)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司;多功能酶標(biāo)儀(型號(hào):SpectraMax i3x)購(gòu)于奧地利Molecular Devices公司;凝膠成像儀(型號(hào):GIS-500)購(gòu)于北京乾明基因技術(shù)有限公司。

1.3 HL-60細(xì)胞培養(yǎng)、ADR耐藥細(xì)胞系的建立

將人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞株快速解凍并置于含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)至貼滿(mǎn)瓶壁后進(jìn)行消化傳代,用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化3 min,觀察到細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)加入培養(yǎng)基終止消化并繼續(xù)培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/ml,取10 ml至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,更換含有0.018 μmol/L ADR[11]的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)基后用新鮮常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,依次用0.092,0.184,0.552,0.920 μmol/L ADR反復(fù)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞,最終獲得在0.920 μmol/L ADR穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞系,即為HL-60/ADR細(xì)胞系,將HL-60/ADR細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.920 μmol/L ADR的培養(yǎng)基中維持其耐藥性。

1.4 CCK-8法檢測(cè)HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的耐藥性及IC50

取HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞及各組轉(zhuǎn)染后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60/ADR細(xì)胞,接種于96孔板,細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔,細(xì)胞貼壁后用0.000,0.092,0.920,1.840,4.600,9.200,18.400,36.800,73.600 μmol/L的ADR分別處理HL-60、HL-60/ADR 24 h,每孔加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)孵育4 h,在酶標(biāo)儀中測(cè)定各孔吸光度值A(chǔ),細(xì)胞活力(%)=(A1-A2)/(A3-A2)×100%,其中A1:加藥孔吸光度值;A2:空白孔(無(wú)細(xì)胞,有培養(yǎng)基)吸光度值;A3:對(duì)照孔(有細(xì)胞,培養(yǎng)基不加ADR)吸光度值。以ADR濃度對(duì)數(shù)為橫軸,抑制率為縱軸繪制濃度-效應(yīng)曲線,根據(jù)線性回歸方程求出半數(shù)抑制率(IC50)。

1.5 qRT-PCR法測(cè)定HL-60、HL-60/ADR中miR-186-5p表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞,用DNA提取試劑盒提取其中總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,對(duì)PCR進(jìn)行擴(kuò)增,miR-186-5p上游引物序列:5′-CCGCGCGCAAATTCTCCTTT-3′,下游引物序列:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,內(nèi)參U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,下游引物序列:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR反應(yīng)體系:10 μl SYBR Mix、1 μl cDNA模板、0.5 μl上下游引物。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min、95 ℃ 1 min、60 ℃ 50 s、72 ℃ 10 min,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt算法分析miR-186-5p表達(dá)。

1.6 HL-60/ADR細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染及其中miR-186-5p表達(dá)測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60/ADR細(xì)胞,分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、miR-186-5p NC組(轉(zhuǎn)染miR-186-5p陰性對(duì)照)、miR-186-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic)、miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組(共轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic和NEK2 mimic),根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒中的操作要求對(duì)各組HL-60/ADR細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染48 h后,qRT-PCR檢測(cè)miR-186-5p表達(dá)、Western blot檢測(cè)NEK2蛋白表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力及IC50值以檢測(cè)HL-60/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性;Western blot檢測(cè)P-gp、GST-π蛋白表達(dá)以驗(yàn)證HL-60/ADR細(xì)胞的耐藥性。

1.7 Western blot測(cè)定各組HL-60/ADR細(xì)胞中NEK2蛋白及耐藥蛋白表達(dá)情況

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60/ADR細(xì)胞,分別用蛋白質(zhì)提取試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒提取其中總蛋白質(zhì)并測(cè)定其中蛋白質(zhì)濃度,將各組蛋白質(zhì)溶液調(diào)至相同濃度并加熱變性,取適量待測(cè)蛋白液,通過(guò)電泳實(shí)驗(yàn)分離蛋白,將分離的蛋白采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,根據(jù)蛋白分子量將目的條帶剪下,置于濕盒中,加入5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉處理,加入兔源NEK2、P-gp、GST-π、GAPDH抗體(1 ∶1 000)進(jìn)行孵育過(guò)夜,用TBST緩沖液洗滌后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔二抗,常溫孵育2 h,經(jīng)過(guò)顯色、定影后進(jìn)行觀察、分析并拍照。

1.8 miR-186-5p與NEK2的靶向關(guān)系鑒定

利用http://www.mirdb.org/預(yù)測(cè)了miR-186-5p與NEK2的靶向作用位點(diǎn)。采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二者之間的靶向關(guān)系,取2.1中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60/ADR細(xì)胞,將構(gòu)建的野生型(NEK2-WT)、突變型(NEK2-MUT)基因靶點(diǎn)的NEK2 3′-UTR熒光素酶表達(dá)載體分別與miR-186-5p mimic、miR-186-5p NC共轉(zhuǎn)染至HL-60/ADR細(xì)胞中,分為NEK2 WT+miR-186-5p NC組(共轉(zhuǎn)染NEK2 WT和miR-186-5p NC)、NEK2 WT+miR-186-5p mimic組(共轉(zhuǎn)染NEK2 WT和miR-186-5p mimic)、NEK2 MUT+miR-186-5p NC組(共轉(zhuǎn)染NEK2 MUT和miR-186-5p NC)、NEK2 MUT+miR-186-5p mimic組(共轉(zhuǎn)染NEK2 MUT和miR-186-5p mimic),培養(yǎng)24 h后測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HL-60/ADR細(xì)胞株的構(gòu)建

HL-60細(xì)胞經(jīng)0.018,0.184 μmol/L ADR處理后細(xì)胞變化不明顯;7 d后增加ADR濃度至0.552 μmol/L時(shí)觀察部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡,繼續(xù)作用2個(gè)月后細(xì)胞基本穩(wěn)定;繼續(xù)增加ADR濃度至0.920 μmol/L時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡,僅有少量細(xì)胞存活細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,經(jīng)過(guò)5個(gè)月得到在0.920 μmol/L ADR中穩(wěn)定生長(zhǎng)的HL-60細(xì)胞株。

2.2 HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞ADR耐藥性比較

在不同濃度ADR作用下,與HL-60細(xì)胞相比,HL-60/ADR細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖1),HL-60細(xì)胞IC50為1.010 μmol/L,HL-60/ADR細(xì)胞IC50為39.730 μmol/L,耐藥指數(shù)為39.25,提示成功構(gòu)建HL-60 ADR耐藥細(xì)胞。

圖1 CCK-8法檢測(cè)HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞活力Figure 1 Cell viability of HL-60 and HL-60/ADR by CCK-8

2.3 HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)比較

與HL-60細(xì)胞相比,HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與HL-60細(xì)胞相比,aP<0.05圖2 qRT-PCR檢測(cè)HL-60、HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)Figure 2 Expression of miR-186-5p in HL-60 and HL-60/ADR cells by qRT-PCR

2.4 各組HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p、NEK2表達(dá)比較

與對(duì)照組相比,miR-186-5p NC組HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p和NEK2表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-186-5p mimic組和miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05),NEK2表達(dá)顯著降低(P<0.05);與miR-186-5p mimic組相比,miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),NEK2表達(dá)顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖3和表1)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與miR-186-5p NC組相比,bP<0.05;與miR-186-5p mimic組相比,cP<0.05圖3 Western blot檢測(cè)各組HL-60/ADR細(xì)胞中NEK2蛋白表達(dá)Figure 3 NEK2 protein expression in HL-60/ADR cells in each group by Western blot

表1 各組HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p、NEK2表達(dá)比較Table 1 Comparison of miR-186-5p and NEK2 expression in HL-60/ADR cells between

2.5 miR-186-5p與NEK2的靶向關(guān)系鑒定

經(jīng)http://www.mirdb.org/查詢(xún),miR-186-5p在NEK2 mRNA 3′UTR有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖4)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NEK2 WT+miR-186-5p NC組相比,NEK2 WT+miR-186-5p mimic組HL-60/ADR細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),NEK2 MUT+miR-186-5p NC組與NEK2 MUT+miR-186-5p mimic組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖5)。

圖4 mirdb網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-186-5p與NEK2的3′-UTR區(qū)序列相互結(jié)合Figure 4 The mirdb website predicts that miR-186-5p binds to the 3′-UTR region sequence of NEK2

與NEK2 WT+miR-186-5p NC組相比,aP<0.05圖5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-186-5p與NEK2的靶向作用關(guān)系Figure 5 Targeting relationship between miR-186-5p and NEK2 by dual-luciferase reporter experiment

2.6 各組HL-60/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性

隨著ADR濃度的增加,各組HL-60/ADR細(xì)胞的細(xì)胞活力逐漸下降;對(duì)照組、miR-186-5p NC組、miR-186-5p mimic組和miR-186-5p mimic+NEK2mimic組IC50值分別為39.730,41.440,12.000,19.390 μmol/L。與對(duì)照組相比,miR-186-5p NC組HL-60/ADR細(xì)胞活力及IC50值之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-186-5p mimic組和miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組細(xì)胞的細(xì)胞活力及IC50值顯著降低(P<0.05);與miR-186-5p mimic組相比,miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組細(xì)胞的細(xì)胞活力IC50值顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與miR-186-5p NC組相比,bP<0.05;與miR-186-5p mimic組相比,cP<0.05圖6 CCK-8法檢測(cè)各組HL-60/ADR細(xì)胞活力Figure 6 Viability of HL-60/ADR cells in each group by CCK-8

2.7 各組HL-60/ADR細(xì)胞耐藥蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比,miR-186-5p NC組HL60/ADR細(xì)胞中P-gp、GST-π蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-186-5p mimic組和miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組HL-60/ADR細(xì)胞中P-gp、GST-π蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與miR-186-5p mimic組相比,miR-186-5p mimic+NEK2 mimic組HL-60/ADR細(xì)胞中P-gp、GST-π蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖7和表2)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與miR-186-5p NC組相比,bP<0.05;與miR-186-5p mimic組相比,cP<0.05圖7 western blot檢測(cè)各組HL-60/ADR細(xì)胞中耐藥蛋白表達(dá)Figure 7 Expression of drug resistance protein in HL-60/ADR cells in each group by Western blot

表2 各組HL-60/ADR細(xì)胞中耐藥蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of drug resistance protein expression in HL-60/ADR cells between

3 討論

AML是一類(lèi)造血干祖細(xì)胞來(lái)源的惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病,病情發(fā)展迅速,常有感染、貧血、出血、髓外組織器官浸潤(rùn)等不良表現(xiàn)[12]?；熓悄壳鞍┌Y治療最有效的手段之一,主要通過(guò)化學(xué)藥物殺滅癌細(xì)胞達(dá)到治療目的,ADR是一種抗生素類(lèi)藥物,具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用,對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng),為廣譜抗腫瘤藥,主要通過(guò)嵌入DNA進(jìn)而抑制核酸的合成發(fā)揮作用,主要適用于急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病等疾病的化療過(guò)程,多項(xiàng)研究表明ADR對(duì)于AML細(xì)胞具有較好的殺傷作用[13,14],但化療過(guò)程中出現(xiàn)的癌細(xì)胞多藥耐藥性是導(dǎo)致化療失敗及預(yù)后不良的主要原因,資料顯示癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如P-gp)的過(guò)度表達(dá)、凋亡相關(guān)因子表達(dá)(如Caspase-3、Bax)的降低[15,16]、細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的改變都是細(xì)胞耐藥性增加的可能原因[17,18]。

miRNA是廣泛存在于真核細(xì)胞中的大小為22個(gè)核苷酸的小分子RNA,能夠與大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本的3′UTR結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制、mRNA衰減、mRNA失活,進(jìn)而阻斷蛋白編碼基因的表達(dá),在白血病等多種癌癥中發(fā)揮促癌或抑癌作用,越來(lái)越多的證據(jù)表明異常miRNA參與了耐藥性的發(fā)展[19,20]。miR-186為miRNA家族成員之一,在鋅指蛋白265基因的第8個(gè)內(nèi)含子處,在多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織中表達(dá)異常,可靶向調(diào)控多種基因,Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-186在宮頸癌組織及細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá),并與宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性密切相關(guān),Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-186可降低乳腺癌細(xì)胞的耐藥性。Lin等[9]和陳穎等[23]研究發(fā)現(xiàn)miR-186在AML患者血清中呈現(xiàn)低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-186可抑制白血病細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究通過(guò)濃度遞增的ADR處理HL-60細(xì)胞,最終獲得在0.920 μmol/L ADR穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞系,與HL-60親本細(xì)胞IC50(1.010 μmol/L)相比,HL-60/ADR細(xì)胞IC50為39.730 μmol/L,耐藥指數(shù)為39.25,提示成功構(gòu)建HL-60 ADR耐藥細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示,與HL-60細(xì)胞相比,HL-60/ADR細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)水平顯著降低,提示miR-186可能參與了HL-60細(xì)胞耐藥性發(fā)生發(fā)展過(guò)程。為探究miR-186與HL-60細(xì)胞耐藥性的關(guān)系,對(duì)HL-60/ADR細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-186-5p mimic組HL-60/ADR細(xì)胞的細(xì)胞活力、耐藥相關(guān)蛋白(P-gp、GST-π)表達(dá)顯著降低,P-gp可將ADR泵出細(xì)胞,而GST-π可降解化療藥物,它們是導(dǎo)致ADR耐藥的關(guān)鍵蛋白[24,25],提示上調(diào)miR-186可顯著改善HL-60/ADR細(xì)胞的ADR耐藥性,增加HL-60/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的化療敏感性。

NEK2是NEKs家族成員,與細(xì)胞染色體不穩(wěn)定聯(lián)系密切,參與細(xì)胞中心體分離、紡錘體形成、有絲分裂等過(guò)程,在多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[26,27],Wen等[28]研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)NEK2的表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,而抑制NEK2表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的耐藥性,Zhou等[26]研究認(rèn)為激活NEK2可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的耐藥性,經(jīng)過(guò)http://www.mirdb.org/查詢(xún),miR-186-5p在NEK2 mRNA 3′UTR有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn),熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證二者之間存在一定的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系,且NEK2可逆轉(zhuǎn)miR-186-5p對(duì)HL-60/ADR細(xì)胞的耐藥抑制,提示miR-186-5p可能通過(guò)下調(diào)NEK2表達(dá)增加HL-60/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性。

綜上所述,上調(diào)miR-186可降低HL-60/ADR細(xì)胞的ADR耐藥性,可能是通過(guò)抑制NEK2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,但本研究未設(shè)置相關(guān)NEK2抑制劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),為本研究的不足之處,因此仍需深入研究。