CNTF在胃癌組織中的表達(dá)及意義

張 丹,黃 晉,趙 倩,馮 云,劉亞萍,任牡丹,盧桂芳,盧新蘭,趙 艷,和水祥(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 7006;陜西科技大學(xué)電智學(xué)院;通訊作者,E-mail:dyyyjxk@xjtu.edu.cn)

胃癌的發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中均居于比較高的位置,是嚴(yán)重影響人民健康的疾病之一[1]。對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討,尋找能夠與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的因子,對(duì)提高胃癌的診斷與治療有著重大的意義。睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)因其生理功能被歸屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員。近年來發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與非神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2]。CNTF也被證實(shí)是骨髓瘤、肝癌的相關(guān)因子[3,4]。CNTF因蛋白結(jié)構(gòu)特征也屬于白介素-6(interleukin-6,IL-6)家族,可以激活多條IL-6家族下游通路,包括JAK/STAT3、Ras/MAKP以及PI3K/AKT等[5]。這些通路是經(jīng)典的腫瘤相關(guān)通路,參與包括胃癌在內(nèi)多種腫瘤形成過程以及侵襲轉(zhuǎn)移行為[6-8]。IL-6家族其他成員包括IL-6、IL-11、白血病抑制因子也被證實(shí)與胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9-11]。綜上,有理由推測(cè)CNTF可能與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān),本研究使用免疫組化法檢測(cè)CNTF在胃癌及其形成過程中的表達(dá),并評(píng)估表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來源

胃癌及癌旁組織選自2011年8月至2012年11月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除病理確診胃癌患者共140例。其中男性103例,女性37例,中位年齡65歲。收集患者的相關(guān)一般信息及臨床病理信息,包括性別、發(fā)病年齡、病史、腫瘤部位、分級(jí)分型、相關(guān)治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡情況等。納入標(biāo)準(zhǔn):孩首次診治,未經(jīng)化療、放療或其他腫瘤相關(guān)生物學(xué)治療處理;虎標(biāo)本組織學(xué)分類、腫瘤分期明確;虎患者或其委托人知情同意;虎術(shù)后依照指南行規(guī)范化治療。排除標(biāo)準(zhǔn):孩曾行腫瘤相關(guān)放化療、免疫治療;虎有嚴(yán)重心、肺、肝、腎等重要臟器功能不全者;虎不配合規(guī)范化治療、隨訪者。

病變胃黏膜組織選自2011年8-12月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行胃鏡檢查并行內(nèi)鏡下活檢患者。中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見指出:慢性萎縮性胃炎與胃癌發(fā)病率呈正相關(guān);上皮內(nèi)瘤變是胃癌最重要的癌前病變[12]。因此分類收集慢性非萎縮性胃炎10例,慢性萎縮性胃炎20例,上皮內(nèi)瘤變14例。經(jīng)患者或其委托人知情同意后收集相關(guān)一般信息。所有標(biāo)本經(jīng)由兩名以上病理醫(yī)師行病理學(xué)診斷。

1.2 方法

對(duì)所收集組織采用免疫組化法檢測(cè)CNTF的表達(dá),表達(dá)量采用免疫組化評(píng)分進(jìn)行表示。

1.2.1 免疫組化 所有組織標(biāo)本使用4%多聚甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片。免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟參照SP免疫組化檢測(cè)試劑盒(博奧森,中國(guó))說明書。切片60 ℃烘烤過夜后置于二甲苯中脫蠟,常規(guī)梯度酒精水化。采用高溫高壓抗原修復(fù),山羊血清工作液封閉后,滴加1 ∶1 000稀釋兔抗人CNTF多克隆抗體(Abcam,英國(guó))37 ℃孵育2 h,洗滌后加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液,后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液。DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,常規(guī)梯度酒精脫水,中性樹膠封片。

1.2.2 組化評(píng)分 顯微鏡下觀察切片,統(tǒng)計(jì)染色得分,具體方法[13]如下:著色細(xì)胞占總細(xì)胞比例0%,0%-10%,10%-50%,50%-80%,80%以上分別記0,1,2,3,4分;著色強(qiáng)度記為1分(淺著色),2分(中等著色)以及3分(強(qiáng)著色);將著色細(xì)胞數(shù)量比例得分與著色強(qiáng)度得分相乘所得即為染色得分。一個(gè)標(biāo)本中任選5個(gè)高倍視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì),最終該標(biāo)本染色得分為5個(gè)分?jǐn)?shù)均值。得分<6視為低表達(dá),≥6分視為高表達(dá)。

1.3 隨訪及評(píng)價(jià)指標(biāo)

以手術(shù)日為起始,采取電話、門診方式隨訪,頻率為每月1次。觀察終點(diǎn)為死亡。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)及總生存期(overall survival,OS)。隨訪時(shí)間為1-88個(gè)月,中位隨訪時(shí)間35個(gè)月。因其他原因死亡及失訪視為截尾數(shù)據(jù),共12例。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件(SPSS,美國(guó))行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)檢驗(yàn)資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,癌組織與相應(yīng)癌旁組織組間比較采取配對(duì)樣本t檢驗(yàn),慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),慢性胃炎、上皮內(nèi)瘤變、胃癌組間比較采用方差分析。定性資料以例數(shù)表示。生存曲線使用Kaplan-Meier法繪制,并使用log-rank檢驗(yàn)比較生存率。多因素分析采用Cox回歸模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CNTF在胃癌及不同病變胃黏膜組織中的表達(dá)

CNTF表達(dá)位置位于胞漿,表現(xiàn)為棕黃色云霧狀或顆粒(見圖1)。CNTF在胃癌及不同病變胃黏膜組織中的表達(dá)量見表1。其中慢性非萎縮性胃炎和萎縮性胃炎組織組化評(píng)分組間比較差異未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.201,P>0.05)。慢性胃炎、胃黏膜上皮內(nèi)瘤變、胃癌組織的組化評(píng)分經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.026,P<0.05)。兩兩比較發(fā)現(xiàn),胃癌組的組化評(píng)分高于胃黏膜上皮內(nèi)瘤變組及胃炎組(P<0.05),但慢性胃炎及上皮內(nèi)瘤變組間差異未提示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胃癌組組化評(píng)分高于相應(yīng)癌旁組織(t=11.006,P<0.05)。

圖1 CNTF在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃黏膜上皮內(nèi)瘤變、胃癌、胃癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of CNTF in chronic non-atrophy gastritis, chronic atrophy gastritis, gastric epithelial neoplasia, gastric cancer, corresponding precancerous tissues

表1 CNTF在胃癌及不同病變胃黏膜組織中的表達(dá)分析Table 1 Analysis of CNTF expression in gastric cancer and different gastric mucosa

2.2 CNTF表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

CNTF的表達(dá)與胃癌病人年齡、性別未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián);與病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有一定關(guān)系(見表2)。

表2 CNTF表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系分析Table 2 Correlation between CNTF expression and clinical pathological characteristics of gastric cancer

2.3 生存分析

對(duì)胃癌病理隨訪時(shí)間1-88月,中位隨訪時(shí)間35月。入組病例1年生存率82.8%,2年生存率67.2%,3年生存率48.3%,5年生存率30.5%,至隨訪結(jié)束存活率23.4%。術(shù)后中位生存時(shí)間在CNTF陰性組為46月,在CNTF陽性組僅27月。CNTF陰性及陽性組Kaplan-Meier生存曲線見圖2,log-rank檢驗(yàn)提示兩組間生存率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.157,P<0.05)。

圖2 CNTF不同表達(dá)胃癌患者生存曲線Figure 2 Survival curve of gastric cancer patients with different CNTF expression

多因素生存分析中,將2.2中已檢驗(yàn)的與CNTF相關(guān)的臨床病理特征包括病理分級(jí)、原發(fā)灶浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期納入Cox回歸模型。表3結(jié)果顯示,浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、CNTF表達(dá)均為胃癌的顯著獨(dú)立預(yù)后因素。

表3 胃癌患者生存時(shí)間的Cox多因素分析Table 3 Cox multi-factor analysis of survival time in patients with stomach cancer

3 討論

腫瘤被公認(rèn)為全身的系統(tǒng)性疾病,其發(fā)生發(fā)展可能與多項(xiàng)體內(nèi)基因及內(nèi)環(huán)境的改變相關(guān),這過程中可能包括了神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)。多個(gè)報(bào)道[14,15]顯示,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可能參與了神經(jīng)對(duì)非神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)作用以及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)腫瘤形成環(huán)境的調(diào)節(jié)。以往關(guān)于CNTF與腫瘤的報(bào)道多集中于神經(jīng)系統(tǒng)。Weis等[16]在多個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及人組織標(biāo)本中檢驗(yàn)CNTF以及其受體的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在所有的星狀細(xì)胞瘤以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,高達(dá)95%以上的腫瘤顯示出CNTF陽性。

CNTF也被證實(shí)與非神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)體腫瘤相關(guān)。Wan等[17]在針對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)行大規(guī)模功能基因篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)CNTF/CNTFR與肝癌生長(zhǎng)密切相關(guān)。Hu等[4]發(fā)現(xiàn)CNTF/CNTFR在多種肝癌細(xì)胞里高表達(dá),而正常肝細(xì)胞中無表達(dá),CNTF可以在不同細(xì)胞系中激活JAK/STAT、Ras/MAPK、PI3K/AKT以及AMPK通路,繼而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖代謝、促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期改變。

CNTF因其蛋白結(jié)構(gòu)隸屬于IL-6家族,IL-6樣細(xì)胞因子可以通過與細(xì)胞膜上含有g(shù)p130亞基的相應(yīng)受體結(jié)合引發(fā)JAK-STAT途徑的活化,是最重要的該通路胞外激活因子[18]。CNTF相關(guān)通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,其中的關(guān)鍵因子已成為胃癌靶向治療的重要靶點(diǎn)。Jackson等[19]研究證實(shí)磷酸化的STAT3高表達(dá)于胃癌細(xì)胞中,推測(cè)STAT3是胃癌發(fā)生及發(fā)展的早期事件。Kanda等[20]發(fā)現(xiàn),阻滯STAT3或JAK可以抑制survivin,減少細(xì)胞存活。Gong等[21]發(fā)現(xiàn)STAT3與VEGF在胃癌組織中有協(xié)同表達(dá)作用,也與血管生成有關(guān)。STAT3表達(dá)水平在不同腫瘤分期中有區(qū)別,證明與局部侵潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),影響到預(yù)后情況[6]。因此有利于推測(cè)CNTF與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

胃癌多具有明確的癌前狀態(tài)與病變階段,其腫瘤的發(fā)生模型可以被歸納為從慢性萎縮性胃炎等癌前疾病到癌前病變最終生成腫瘤的長(zhǎng)達(dá)數(shù)年甚至數(shù)十年的過程[22]。因此本研究首先對(duì)不同病變的胃黏膜臨床標(biāo)本中CNTF進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)CNTF在慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎組間表達(dá)差異不明顯。在慢性胃炎及上皮內(nèi)瘤變組中表達(dá)差異也不明顯,但在胃癌組織中CNTF表達(dá)較慢性胃炎組織及癌前病變組織均可見顯著上升,也顯著高于相應(yīng)癌旁組織,提示了CNTF在腫瘤發(fā)生過程中主要起到促進(jìn)作用的過程,也提示了CNTF在腫瘤中表達(dá)的特異性。

在CNTF表達(dá)與胃癌臨床病理特征的研究中發(fā)現(xiàn),CNTF表達(dá)與年齡、性別的一般特征無明顯關(guān)聯(lián)。病理分級(jí)反映腫瘤惡性程度及預(yù)后,統(tǒng)計(jì)分析提示CNTF表達(dá)量在中高分化組低于低分化-未分化組,側(cè)面提示了CNTF與疾病進(jìn)程、預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。CNTF表達(dá)與腫瘤局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。以上因素是胃癌臨床分期的決定性因素,也是代表胃癌遠(yuǎn)期預(yù)后最關(guān)鍵的特征,在既往的報(bào)道中,均以胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素存在[23,24]。因此提示CNTF的表達(dá)可能與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān),進(jìn)而影響病人預(yù)后。

在進(jìn)一步的生存分析中發(fā)現(xiàn)CNTF陽性病人生存率低于CNTF陰性病人。將影響預(yù)后及與CNTF表達(dá)相關(guān)的關(guān)鍵特征納入多因素分析中,發(fā)現(xiàn)除腫瘤局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以外,CNTF表達(dá)也是影響病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,證實(shí)了CNTF表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系。

綜上,CNTF在胃癌、不典型增生、胃炎胃黏膜中存在差異性表達(dá);CNTF表達(dá)量與腫瘤臨床病理分級(jí)分期相關(guān),并且是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。提示CNTF可能參與了胃癌發(fā)生、進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等過程,并影響疾病預(yù)后。之后的工作會(huì)通過對(duì)CNTF幾條主要通路的研究繼續(xù)明確其具體作用機(jī)制,挖掘CNTF可能的臨床價(jià)值。