高通量測(cè)序分析根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性的影響

張麗芳 李艷瓊 蔡建 高秀 徐晴芳 劉威良 楊衛(wèi)星 胡海林

摘要：【目的】分析根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性的影響?！痉椒ā客ㄟ^(guò)高通量測(cè)序技術(shù)、土壤性質(zhì)測(cè)定及生物信息學(xué)技術(shù)分析感染根結(jié)線蟲(chóng)馬鈴薯和健康馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性差異?！窘Y(jié)果】從6個(gè)土壤樣品中共獲得3界12門(mén)34綱77目171科332屬526種的土壤真菌。對(duì)物種多樣性指數(shù)分析后，發(fā)現(xiàn)感染根結(jié)線蟲(chóng)馬鈴薯病株與健康馬鈴薯植株的根際土壤真菌群落多樣性和土壤性質(zhì)均存在顯著性差異。對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行物種組成分析后，在門(mén)水平中，感病植株根際土壤真菌Basidiomycota豐度較健康植株根際土壤真菌豐度高，Ascomycota豐度低于健康植株根際土壤;在科水平中，病株根際土壤豐度較高的菌群有Nectriaceae和Trimorphomycetaceae;在屬水平中，健康植株根際土壤豐度較高的菌群為鐮刀菌屬Fusarium、被孢霉屬M(fèi)ortierella和未知分類(lèi)毛殼菌科屬u(mài)nclassified_f_Chaetomiaceae?！窘Y(jié)論】感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯與健康馬鈴薯根際土壤真菌群落豐度在門(mén)、科和屬水平上均存在差異，為進(jìn)一步研究馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生和防治提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲(chóng);馬鈴薯根際土壤;土壤性質(zhì);高通量測(cè)序;真菌多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S154;S 532

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-03 84（2021）08-0936-06

High-Throughput Sequencing on Fungal Diversity in Potato Rhizosphere Soil

Infested by Root-knot Nematodes

ZHANG Lifang 1， LI Yanqiong 2， CAI Jian 1. GAO Xiu 1， XU Qingfang 1. LIU Weiliang 1， YANG Weixing 1， HU Hailin 3*

（I. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan 65501I， China; 2. Collegeof Agronomy and Life Sciences， Kunming University Kunming， Yunnan 6502 14. China; 3. College of Mathematics andStatistics， Qujing Normal University Qujing， Yunnan 65501I. China ）

Abstract： 【Objective】Diversity of the thizosphere soil fungal community in potato field as affected by the presence of root-knot nematodes was investigated using high-throughput sequencing technique. 【Methods】The properties and bioinformaticsof thizosphere soils surrounding healthy and infested potato plants were compared to analyze the possible effects of differentialfungal community on the occurrence and control of the disease. 【Results】There were 526 fungi species belonging t0 332genera. 171 families. 77 0rders. 34 classes， 12 phyla， and 3 kingdoms identified from the 6 field specimens. Significantlydifferentiations on the fungal community diversity and properties of the thizosphere soils on the healthy and infested potato lotswere found. In the infected areas， Basidiomycota was the more abundant phylum， but Ascomycota less， than on the healthy lots.At family level. Nectriaceae and Trimorphomycetaceae were more abundantly found in the soil of diseased plants， while atgenus level， Fusarium. Mortierella， and some unclassified Chaetomiaceae more richly in the soil of healthy plants.【Conclusion】Significant differences in the abundance of fungi in the thizosphere soils of potatoes infested by the root-knotnematodes and the healthy counterparts were found at phylum， family， and genus levels. The information would aid furtherstudy on the occurrence and control of potato root-knot nematodes.

Key words： Root-knot nematodes; potato thizosphere soils; soil properties; high throughout sequencing technology; fungidiversity

0 引言

【研究意義】馬鈴薯Solanum tuberosum L隸屬茄科茄屬，是世界上第四大糧食作物，是云南省三大糧食作物之一，據(jù)云南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截至2018年底，云南省馬鈴薯種植面積達(dá)5.628×10s hm2，產(chǎn)量（折糧）209.2萬(wàn)t，云南省馬鈴薯種植面積、總產(chǎn)量均居全國(guó)第3位，同時(shí)也是根結(jié)線蟲(chóng)的主要寄主之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，微生物多樣性指標(biāo)作為重要的土壤健康指標(biāo)受到廣泛的關(guān)注，而馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)的侵染主要從根部開(kāi)始侵染，同時(shí)促使根際土壤中的菌群更容易感染植株。據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外馬鈴薯寄生性線蟲(chóng)至少有24屬68種，其中一些種類(lèi)嚴(yán)重危害馬鈴薯的生產(chǎn)，我國(guó)已報(bào)道的馬鈴薯寄生線蟲(chóng)有16屬44種，大多數(shù)是墊刃屬、滑刃屬等，馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)屬墊刃目線蟲(chóng)病害。在這些植物病原線蟲(chóng)中，馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne spp.占損失的50%以上[1-3]。根結(jié)線蟲(chóng)在土壤中受許多微生物影響，線蟲(chóng)寄生真菌被認(rèn)為是自然條件下控制線蟲(chóng)的主要因子之一[4-7]，所以推測(cè)感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯和健康馬鈴薯根際微環(huán)境土壤間存在差異。每棵植株所處的土壤成分、施肥情況和健康狀態(tài)等微環(huán)境都會(huì)有細(xì)微的差別.都能靈敏地反映在其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)上，而表現(xiàn)出一種植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，就其豐度而言，數(shù)量在300～55 000[8-12]。然而，馬鈴薯植株健康狀態(tài)變化與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，土壤微生物菌群對(duì)調(diào)節(jié)植株根際微環(huán)境起到很大作用。利用傳統(tǒng)的方法獲得的微生物僅占環(huán)境微生物的0.1%～1.0%[13]，無(wú)法全面反映環(huán)境微生物群落的真實(shí)狀況。近年來(lái)，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，利用Illumina Mi Seq高通量測(cè)序技術(shù)，現(xiàn)代生物信息學(xué)手段，可獲得龐大的數(shù)據(jù)信息，該技術(shù)具有高通量、價(jià)格低、運(yùn)行周期短的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究[14-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用Illumina Mi Seq高通量測(cè)序技術(shù)探討感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯和健康馬鈴薯根際微環(huán)境土壤間真菌群落差異有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)云南省曲靖市馬龍縣馬鈴薯生產(chǎn)基地健康馬鈴薯和感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯根際土壤真菌群落進(jìn)行測(cè)序分析，探索其根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異及其影響因素，為感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯根際土壤微環(huán)境改善，病害防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1土壤樣品采集地概況

試驗(yàn)地位于云南省曲靖市馬龍縣月望鄉(xiāng)范家新屯馬鈴薯種植區(qū)，經(jīng)度103°63'，緯度25°33'，海拔2090.00 m，屬低緯度高原季風(fēng)氣候，年平均氣溫13.6℃，年均降水量1001.8 mm，每年平均日照1985h以上，縣城年均氣溫13.4℃，每年無(wú)霜期24ld。冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，日照較長(zhǎng)，熱量不足，雨量充沛，但干冷同期，雨熱同季，干濕分明，降水集中。各采樣田的氣候條件、栽培管理措施和水肥用量基本一致。土壤類(lèi)型為磚紅壤。

1.2土壤樣品采集方法

在6塊試驗(yàn)田中，按照5點(diǎn)采樣法采集20 cm深的土壤樣品，去除石塊和大顆粒雜質(zhì)，抖落根際土壤，進(jìn)行混裝后帶回實(shí)驗(yàn)室，用20目的篩子過(guò)篩，處理組和對(duì)照組分別標(biāo)記為MLE1，MLE2，MLE3，MLCKI，MLCK2，MLCK3.每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，分裝至無(wú)菌離心管中，1份用于土壤性質(zhì)測(cè)定，另外3份密封后立即放入-80℃冰箱，用于DNA提取。

1.3土壤性質(zhì)測(cè)定

土壤pH采用pH酸度計(jì)測(cè)定，有機(jī)質(zhì)（SOM）含量采用重鉻酸鉀氧化容量法測(cè)定，速效氮（ AN）含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效磷（AP）含量以NH4F_HC1溶液提取后采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，速效鉀（ AK）含量采用1.0 mol.L-l乙酸銨浸提后以火焰光度計(jì)測(cè)定。

1.4高通量測(cè)序分析

土壤樣品送至美吉生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司進(jìn)行DNA提取和高通量測(cè)序。擴(kuò)增引物為ITSIF（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）.ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴(kuò)±曾片段長(zhǎng)度為300 bp[18]。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorrM_ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，按照相應(yīng)比例的混合后進(jìn)行Miseq文庫(kù)構(gòu)建、拼接質(zhì)控、OTU聚類(lèi)、數(shù)據(jù)分析與信息挖掘。土壤性質(zhì)和真菌群落多樣性均采用SPSS17.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同樣品土壤性質(zhì)分析

由表1可知，6種樣品根際土壤pH均偏酸性，其中，健康馬鈴薯根際土壤pH稍偏高，感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯根際土壤pH酸性略強(qiáng)，二者間存在差異顯著性（P<0.05）。土壤有機(jī)質(zhì)含量（ OM）、速效磷（ AP）、速效鉀（AK）和速效氮（AN）均存在差異顯著性（P<0.05），總體而言，以上4種物質(zhì)含量在健康馬鈴薯根際土壤中含量略高。

2.2樣品稀釋曲線分析

由圖1可知，樣品的稀釋曲線呈平穩(wěn)趨勢(shì)發(fā)展，未達(dá)到飽和。可見(jiàn)，雖然取樣、測(cè)試數(shù)據(jù)均存在科學(xué)性，樣品信息存在較高的客觀土壤環(huán)境真菌群落構(gòu)成置信度，可客觀體現(xiàn)土壤樣本各自真菌群落，但也存在未發(fā)現(xiàn)部分少量微生物的可能性，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可以反映樣品當(dāng)中的絕大多數(shù)真菌信息。

2.3測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)及多樣性指數(shù)分析

根據(jù)測(cè)序獲得的原始序列和有效序列分析可知（表2），所有序列經(jīng)質(zhì)控分析得到的有效序列占比均在96%以上，說(shuō)明原始序列利用率較高，絕大部分都可用作后續(xù)數(shù)據(jù)分析。各土壤真菌多樣性指數(shù)覆蓋率均為99.7%，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)合理真實(shí)，測(cè)序數(shù)據(jù)基本涵蓋了馬鈴薯根際土壤中的真菌類(lèi)群，能體現(xiàn)馬鈴薯根際土壤真實(shí)環(huán)境中真菌特征。通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，感染根結(jié)線蟲(chóng)馬鈴薯根際土壤真菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)為2.59～4.19，Simpson指數(shù)為0.05～0.26，Ace指數(shù)為574.26～1013.8，Chao指數(shù)為586.14～1025.57，其中，感染根結(jié)線蟲(chóng)馬鈴薯根際土壤真菌菌落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)與健康馬鈴薯根際土壤真菌群落均存在顯著性差異。從多樣性指數(shù)可看出，健康馬鈴薯根際土壤Shannon指數(shù)大于感染根結(jié)線蟲(chóng)馬鈴薯根際土壤，而Simpson指數(shù)恰好相反，說(shuō)明健康馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性更高。由Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可看出，健康馬鈴薯根際土壤真菌群落豐富度均高于處理組，說(shuō)明健康馬鈴薯根際土壤真菌群落豐富度高于處理組。

2.4物種組成分析

2.4.1物種組成Venn圖分析 由圖2可直觀比較出兩大組樣品中OTU數(shù)目組成情況，兩組樣品中共有OTU數(shù)548個(gè)，占全部OTU的2g%，MLE組特有OTU數(shù)為189，占全部OTU的10%;MLCK組OTU數(shù)594，占全部OTU的32%，由此看出兩大組樣品中真菌分布差異明顯。

2.4.2土壤真菌群落組成 6個(gè)土壤樣品測(cè)序共獲得3界12門(mén)34綱77目171科332屬526種的土壤真菌。

2.4.3真菌在門(mén)水平上比較 對(duì)MLEI、MLE2、MLE3、MLCKI、MLCK2、MLCK3共6個(gè)樣品中的真菌群落分別求和后，對(duì)6個(gè)樣品做柱狀圖分析，結(jié)果如圖3所示，6個(gè)樣品豐富度相似，6個(gè)樣品中豐度占優(yōu)勢(shì)的菌門(mén)均為擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota，子囊菌門(mén)Ascomycota和球囊菌門(mén) Mortierellomycota， 而MLCK1、MLCK2和MLCK3中子囊菌門(mén)Ascomycota和球囊菌門(mén)Mortierellomycota略高于另外3個(gè)樣品。

2.4.4真菌在科水平上比較 如圖4所示，6個(gè)樣品在科水平上存在差異，MLCKI、MLCK2和MLCK3中真菌菌群豐富度高于另外3個(gè)樣品，MLE1、MLE2和MLE3中豐度較高的菌群有赤殼科Nectriaceae、Trimorphomycetaceae、被孢霉科Mortierellaceae、 毛殼菌科Chaetomiaceae和裸囊菌科Gymnoascaceae，而MLCKI、MLCK2和MLCK3中豐度較高的菌群有赤殼科Nectriaceae、被孢霉科Mortierellaceae和毛殼菌科Chaetomiaceae。

2.4.5真菌在屬水平上比較 如圖5所示，6個(gè)樣品中主要菌群為沙蜥屬Saitozyma、鐮刀菌屬Fusarium、被孢霉屬M(fèi)ortierella、未知分類(lèi)毛殼菌科屬u(mài)nclassifiedf_Chaetomiaceae和赤霉菌屬Gibberella，在MLEI、MLE2和MLE3中豐度較高的菌屬為Saitozyma，而Fusarium和Mortierella次之。在MLCK1、MLCK2和MLCK3中豐度較高的菌屬為Fusarium、Mortierella和unclassified_f_ Chaetomiaceae.

3討論與結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了感染根結(jié)線蟲(chóng)馬鈴薯根際土壤真菌多樣性及其群落組成，結(jié)果表明，從物種組成韋恩圖可看出，健康植株根際土壤的OTU數(shù)量較感病植株根際土壤多，在門(mén)水平中，感病植株根際土壤真菌Basidiomycota豐度較健康植株根際土壤高，Ascomycota豐度低于健康植株根際土壤;在科水平中，病株根際中豐度較高的菌群有Nectriaceae和Trimorphomycetaceae; 在屬水平中，健康植株根際土壤中豐度較高的菌群為Fusarium、Mortierella、unclassified_f_Chaetomiaceae和Plectosphaerella。健康植株根際土壤真菌群落Ascomycota高的原因可能是Ascomycota都是寄生或腐生，部分感病植株根系腐爛，根際分泌物大量減少甚至無(wú)分泌物，造成Ascomycota賴以寄生的根際營(yíng)養(yǎng)成分下降，所以感病植株根際土壤中Ascomycota豐度降低;相反，感病植株根際土壤中Basidiomycota豐度高的原因是由于病根腐爛過(guò)程中，與植株具有共生關(guān)系的擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota勢(shì)必緊急動(dòng)員，通過(guò)與植物形成共生菌根來(lái)抵御或彌補(bǔ)根結(jié)線蟲(chóng)感染對(duì)植株的傷害[19-20]，所以表現(xiàn)出其豐度顯著提高。在科水平中，Nectriaceae豐度高的原因可能是Nectriaceae是一種導(dǎo)致植株形成叢枝菌根并致使根際腐爛的致病菌，所以豐度偏高，與Nonaka等研究[6.21]相符。本研究中感染根結(jié)線蟲(chóng)的馬鈴薯根際土壤真菌群落的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon-wienner指數(shù)趨勢(shì)相同，而與pH相反;Simpson指數(shù)與有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷及速效鉀含量變化相反，說(shuō)明土壤真菌豐度和多樣性與土壤養(yǎng)分含量密切相關(guān)，下一步將進(jìn)一步明確其相關(guān)性，通過(guò)各種手段改善土壤pH和理化性質(zhì)等因素改變土壤真菌群落結(jié)構(gòu)來(lái)控制根結(jié)線蟲(chóng)病害的擴(kuò)展和蔓延。

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（責(zé)任編輯：林海清）

收稿日期：2021-0308初稿;2021-06-19修改稿

作者簡(jiǎn)介：張麗芳（ 1987-），女，博士，講師，研究方向：植物病理（E-mail： 752859175@qq.com）

*通信作者：胡海林（ 1986-），男，碩士，助教，研究方向：馬鈴薯病害（E-mail： 243902676@qq.com）

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃計(jì)劃青年項(xiàng)目（2018FD080）：曲靖師范學(xué)院青年項(xiàng)目（2019QN002）