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    不同氮源對海洋真菌BH0531發(fā)酵液殺線蟲活性的影響

    2015-10-20 00:10蒙春蕾王勇勇黃敏蔡爽孟慶恒孫建
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2015年5期
    關鍵詞:氮源

    蒙春蕾 王勇勇 黃敏 蔡爽 孟慶恒 孫建華

    摘要:海洋來源的枝頂孢霉(Acremnium,BHO531)是一株以松材線蟲為靶標篩選出的殺線蟲真菌。氮源的化合態(tài)和種類對該菌株的生長以及代謝產(chǎn)物的活性有顯著影響。研究結(jié)果顯示,不同氮源對菌體生長量的影響差異顯著,有機氮優(yōu)于無機氮;代謝物的殺線蟲活性則表現(xiàn)為無機氮優(yōu)于有機氮,其中以NaNO3為氮源的發(fā)酵液對松材線蟲的殺線率以及NH4cl為氮源的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的殺線率分別高達95.67%和96.60%,均高于有機氮源中最高的蛋白胨。根結(jié)線蟲對各種無機氮源發(fā)酵液的敏感性普遍高于松材線蟲。此外,經(jīng)高溫處理的代謝物仍觀察到較強的殺線蟲活性,顯示出良好的熱穩(wěn)定性。

    關鍵詞:海洋枝頂孢霉;氮源;殺線活性;松材線蟲;根結(jié)線蟲

    中圖分類號:Q939.9;5;432.4.5 文獻標志碼:A 文章編號:1002-1302(2015)05-0121-03

    植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物,其寄生范圍廣,環(huán)境適應性強,幾乎每種作物都受到植物線蟲的侵害,其危害程度僅次于真菌,已超過細菌、病毒,成為第二大植物病害,防控形勢嚴峻。真菌殺線劑(具殺線活性的代謝產(chǎn)物)是一類環(huán)境友好型生防因子,越來越受到廣泛重視。已經(jīng)報道的具有殺線蟲活性的真菌種類超過700種,已分離得到的殺線蟲活性代謝產(chǎn)物多達230余種。這些殺線蟲真菌及其代謝物的研究主要集中在陸生性真菌(包括病原菌和內(nèi)生真菌),如淡紫擬青霉活菌劑和總狀共頭霉(Srl8菌)等。海洋來源的枝頂孢霉(Acremnium,BHO531)是一株已被證實具有較好殺線蟲作用的海洋真菌。不同于陸生性真菌,該菌在添加海水的培養(yǎng)基中的生長情況和殺線蟲活性均優(yōu)于普通察氏培養(yǎng)基,且其代謝活性物具有含氮化合物屬性;因此,探究不同化合態(tài)的氮源對該菌在察氏培養(yǎng)基生長及其代謝物殺線蟲活性的影響,將有助于活性代謝產(chǎn)物發(fā)酵條件的優(yōu)化,克服海水高鹽組分對發(fā)酵設備的影響。據(jù)此,本試驗以松材線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲二齡幼蟲(.T2)為對象,以殺線蟲效果(殺線率)為指標,測定了NaNO3、KNO3NH4NO3、(NH4),SO4、NH4Cl等不同氮源對BH0531菌株生長狀況及其活性代謝產(chǎn)物的影響,旨在為進一步優(yōu)化該菌的發(fā)酵條件提供試驗依據(jù)。

    1.材料與方法

    1.1試驗材料

    1.1.1供試菌株海洋枝頂孢霉(Acremnium,BHO531),菌種保藏號CGMCC-5445;灰葡萄孢霉(Batrytisnerea,BC菌),以上菌種由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

    1.1.2供試線蟲松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus),中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供;黃瓜根結(jié)線蟲(Meloido-gyneincognita)取白天津市寶坻區(qū)黃瓜大棚基地。

    1.1.3供試培養(yǎng)基(1)活化培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g/L煮汁,葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L,蒸餾水定容至1000mL;用于活化BH0531菌株。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基:2g/L氮源,1g/LKH2O4,0.5g/LMgSO40.5g/LKCl,0.01g/LFez(SO4)3·5H2O,20g/L葡萄糖,pH值自然。氮源分別為NaN0,、KNO3、NH4NO4、(NH4):SO4、NH4C1、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏。(3)大麥仁培養(yǎng)基:10g大麥仁,8mL去離子水,大試管浸泡3~6h,滅菌,用于BC菌培養(yǎng)。

    1.2試驗方法

    1.2.1BH0531菌株的培養(yǎng)將保藏的BHO531菌種接種至活化培養(yǎng)基斜面試管,26qC培養(yǎng)5~7d。

    1.2.2灰葡萄孢霉的培養(yǎng)

    將灰葡萄孢霉接人大麥仁培養(yǎng)基,21℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d,用于松材線蟲的培養(yǎng)。

    1.2.3

    松材線蟲的培養(yǎng)將松材線蟲接種于培養(yǎng)好的BC菌上,25℃下避光培養(yǎng)7d;通過貝爾曼漏斗法收集松材線蟲,制備成濃度為10000條/mL的線蟲懸液。1.2.4黃瓜根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)的制將大田取得的黃瓜病根剪成1cm小段;在1%次氯酸鈉溶液中漂洗4min,再在勻漿機里攪拌2min;利用100目、300目和500目的網(wǎng)篩沖洗并收集蟲卯。再將卯收集到的離心管中,在底部加入40%蔗糖溶液,3500r/min密度梯度離心5min。之后吸取界面溶液過500目網(wǎng)篩,反復沖洗收集卯。將上述收集得到的卯置于已消毒的培養(yǎng)皿中,墊上濕潤濾紙,25qC下孵化4d。

    1.2.5發(fā)酵液的制取活化的BHO531菌株斜面,加入無菌水洗脫孢子,制備濃度為2×10。CFU/mL的孢子懸液,以1%的接種量分別接入不同氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中,26℃、120r/min培養(yǎng)96h。發(fā)酵菌液經(jīng)離心除菌(6000r/min30min,Eppendorf-5810),再經(jīng)孔徑為O.22um的微孔濾膜過濾,即為發(fā)酵濾液,用于活性分析。

    1.2.6不同氮源發(fā)酵液殺線蟲活性檢測

    將所獲發(fā)酵液分為滅菌組和未滅菌組,以無菌水為對照,分別以松材線蟲和黃瓜根結(jié)線蟲(J2)為靶標,進行殺線蟲活性檢測。具體方法如下:取96孔板,每孔加入靶標線蟲懸液10μL(約100條),再分別加入100μL不同氮源的發(fā)酵液,設3次重復,25℃下培養(yǎng),3d后體視顯微鏡下觀測線蟲死亡情況,按下式統(tǒng)計線蟲校正死亡率:

    線蟲校正死亡率=(處理線蟲死亡率一對照線蟲死亡率)/(1一對照線蟲死亡率)×100%。

    應用SPSS12.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析,并且采用Duncan's新復極差法進行差異顯著性分析。

    2.結(jié)果與分析

    2.1不同氮源對BH0531菌體生長的影響

    試驗結(jié)果(圖1、表1)表明,不同氮源對BHO531菌絲體的外觀和生物量有明顯影響。圖1結(jié)果顯示,經(jīng)不同無機氮源發(fā)酵后,發(fā)酵液透明,呈淡黃色,菌絲球結(jié)構(gòu)松散,外觀不規(guī)整(圖1-A至E);而在蛋白胨和酵母膏條件下,菌絲體外觀結(jié)構(gòu)緊密,呈均勻球狀分布,直徑明顯大于無機氮源條件(圖1-G至H);牛肉膏中菌絲體則介于二者之間(圖l-F)。生物量測定結(jié)果進一步證實了不同氮源對該菌的影響存在明顯的差異(α=0.05),尤其體現(xiàn)在有機氮源和無機氮源之間(表1)。不同氮源對菌體生長的作用由大到小依次為蛋白胨>酵母膏>牛肉膏>KNO3>NaNO3>(NH4)2SO4>NH4NO3>NH4Cl。

    2.2不同氮源發(fā)酵液對松材線蟲活性的影響

    在試驗選定的8種氮源中,以NaNO,作為氮源的發(fā)酵液表現(xiàn)出了較好的殺線蟲活性,殺線率≥90%,達到A級(表1),其次為蛋白胨、NH4C1和KNO3,。值得關注的是除NH4cl外,其余3種氮源的發(fā)酵液經(jīng)滅菌后其代謝產(chǎn)物仍然具有≥60%的殺線活性,表明活性代謝產(chǎn)物具有較好的耐熱性。表1的分析結(jié)果顯示,代謝物的殺線蟲活性主要與氮源的種類密切相關,菌體生物量與代謝物殺線蟲活性在選定用量范圍內(nèi)未顯示出明確的相關性。這一結(jié)果提示,選用適當?shù)臒o機氮源如NaNO+用于發(fā)酵,從代謝活性物的角度可以代替海水培養(yǎng)基來獲得高活性的代謝產(chǎn)物。

    2.3不同氮源發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲(.T2)存活的影響

    研究結(jié)果表明,BHO531代謝物不僅對松材線蟲有確切的殺線活性,對根結(jié)線蟲也有顯示出很強的殺線活性。不同氮源發(fā)酵液在滅菌前后,對黃瓜根結(jié)線蟲幼蟲J2的殺線率均較高,除牛肉膏、酵母膏外,其他6種氮源對根結(jié)線蟲的校正死亡率均大于75%(表2)。以NH4CI為氮源的發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的殺線率最高,達到96%,與該發(fā)酵液對松材線蟲的殺線率差異較大。表2結(jié)果還顯示,滅菌組中各氮源發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲殺線率不僅差異顯著,還突出地表現(xiàn)出無機氮源的優(yōu)勢;未滅菌組中有機氮源間殺線率差異極顯著(P<0.01),無機氮源發(fā)酵液間殺線率差異雖不顯著,但其殺線率均在B級(>85%)以上,具有較高的殺線活性。進一步表明選用適當?shù)臒o機氮源用于BHO531活性代謝物的發(fā)酵,可以用來替代海水培養(yǎng)基獲得高活性的代謝產(chǎn)物。

    3.討論

    海洋來源的枝頂孢霉(Acremnium,BH0531)是一株以松材線蟲為靶標篩選出的生防菌,但該菌在海水培養(yǎng)基中顯示的生長優(yōu)勢并不適用于規(guī)模發(fā)酵的設備條件要求。而含氮無機鹽是海水中的重要成分,因此,探究其在不含海水的培養(yǎng)條件下的生長要素及其對殺線蟲活性代謝物的影響就顯得十分必要。研究結(jié)果表明,不同氮源,特別是無機氮源對BHO531生長狀況的影響較大。有機氮源雖然有利于菌絲體的增加,但其殺線率的優(yōu)勢并未隨菌絲體的增加而提高。試驗結(jié)果表明,以NaNO3和NH4C1 2種不同化合態(tài)的無機氮作為氮源時,菌體的生長狀況雖然不如有機氮,但所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對松材線蟲與黃瓜線蟲分別顯示出較高的抑制率,且其活性產(chǎn)物均顯示出良好的熱穩(wěn)定性,為今后進一步優(yōu)化發(fā)酵條件、完全取代海水培養(yǎng)基提供了試驗依據(jù)。

    研究還發(fā)現(xiàn),BHO531代謝物對松材線蟲和根結(jié)線蟲的殺線效果存在一定的差異。根結(jié)線蟲對于以察氏培養(yǎng)基為基礎的不同氮源的發(fā)酵產(chǎn)物的敏感性明顯高于松材線蟲。有報道顯示,不同離子對南方根結(jié)線蟲的排斥性為K+、NH+和N03>Cl,其中NH+和NO+組成的化合物NH4NO3對南方根結(jié)線蟲有強烈的排斥力,且隨著濃度升高而上升。所不同的是,各種含氮無機鹽在BH0531的培養(yǎng)過程中作為氮源會被菌體轉(zhuǎn)化利用,而且用量僅為2g/L,低于察氏培養(yǎng)基的標準用量(3g/L),因此其高效的殺線蟲活性主要取決于代謝活性物的生成。至于其活性代謝物殺線蟲的機理還有待深入研究。

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